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E1 A激活基因阻遏子调控体外培养人VSMCs 表型转换的机制研究 硕士研究生：胡叶 指导教师：韩雅玲 教授 专业名称：内科学 摘 要 smoothmuscle 研究背景和目的：血管平滑肌细胞(vascular cells， VSMCs)增殖与迁移是导致动脉粥样硬化和血运重建后再狭窄等血管 狭窄性损伤形成的重要原因。而血管损伤后VSMCs由分化表型转变为 去分化表型的过程是细胞增碹和迁移的始动因素，也是增生性血管疾 病的共同病理基础。E1A激活基因阻遏子(cellularof repressor EIA．stimulated 转录调控相关基因。研究表明，CREG蛋白与6．磷酸甘露醇胰岛素样 factorII／mannose 乍长因子II受体(insulin．1ike growth 6．phosphate 分化的作用。先前报道本室建立的人胸廓内动脉VSMCs克隆株 HITASY在不同培养条件下可发生分化和去分化表型的相互逆转，应用 基因，提示其表达可能与VSMCs分化密切相关。我们先前的研究发现， SM CREG基因能够诱导体外培养的大鼠VSMCsc【．actin表达并促进细 胞向分化表型转换。大鼠颈动脉拉伤实验亦证实，CREG蛋白表达与 血管损伤后再狭窄过程中VSMCs增殖能力呈负相关。这些提示CREG 基因具有促进分化、抑制增殖等促进VSMCs向分化表型转换的功能， 但CREG基因在这一过程中的作用机制及该基因对VSMCs迁移的影 响迄今尚未见报道。 ·，。 kinase，MAPK) 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated口rotein 是丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，由3个成员组成，即细胞外信号调节激 酶(extracellular-signal regulatedkinase，F,RK)，应激活化蛋白激 protein 酶JNK和蛋白激酶P38。MAPK介导的信号转导途径是细胞内多种增 殖、分化、迁移等信息传递的共同通路，是细胞外信号引起细胞核反 应的会聚点。活化的MAPK通过转位进入胞核内，激活多种早期反应 的核内癌基因，如fos、myc、jUll等，启动和促进与细胞增殖、分化有 关的蛋白质基因的转录和表达，引起细胞增殖、促进蛋白质和胶原的合 成等。最近有研究报道CREG蛋白可以作为ERK信号转导途径抑制剂 抑制心肌细胞增殖。本实验的目的是探讨CREG蛋白对VSMCs增殖 和迁移活性的影响及其作用机制。 中的CREG cDNA经pVAXJ质粒正向克隆至逆转录病毒载体pLNCX2； 同时，将CREG cDNA反向克隆至逆转录病毒载体pLXSN，分别构建 (2)以带绿色 pLXSN(．)／CREG，筛选阳性克隆送TaKaRa公司测序。 fluorescent 荧光蛋白(green 照，用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体感染293细胞，包装出 完整的逆转录病毒后，感染HITASY。经G418筛选，获得稳定感染的 blot等方法检测感染 细胞克隆。 (3)应用免疫荧光染色、