apc基因甲基特异性pcr检测方法的建立及其在肺癌诊断中的应用.pdfVIP

／4粥基因甲基化特异性PcR检测方法的建立及其在肺癌诊 断中的应用 中文摘要 背景 DNA甲基化对转录的抑制作用是表观遗传学中一项非常重要的 内容。人类基因组中约有29 000个cpG岛，超过60％的基因启动子 和第一外显子都包含cpG岛。DNA甲基化与肿瘤的关系正日益引起 人们的关注，检测DNA的异常甲基化有助于深入理解肿瘤形成机制， 并且可为肿瘤的早期诊断、病理分型、疗效评估及复发监测等提供十 分重要的信息。 2004年我国卫生部提供的资料显示肺癌的发病率与死亡率已居恶 性肿瘤之首。彳PC基因，即腺瘤性结肠息肉病相关基因(ademomatous polyposis c01j，彳尸C)，其蛋白质的表达在肺癌中降低，却很少发现突 变。 目的 建立含有弱阳性质控品的甲基化特异性PcR(methylationspecmc PcR，MsP)检测技术。研究爿JDc基因甲基化对转录的影响及其与肺 癌的关系。 方法 酚一氯仿法提取脐带血淋巴细胞DNA，转甲基制备阳性模板，化 学修饰，MsP后获得目的片段，克隆到pMDl8一T质粒载体，测序筛 选阳性和阴性质粒，紫外分光光度法对阳性质粒定量，优化MsP的 各项参数，制备弱阳性质控品。用建立的MsP技术分析103份DNA 标本的甲基化状态，这其中包括：39例肺癌病例(78份DNA)：2 例肺部其他肿瘤病例(4份DNA)；18例正常人标本(14份肺组织 DNA，4例门诊血的淋巴细胞DNA)；3株肺癌细胞。Trizol法提取 Green 组织和细胞RNA，以卢一口c，加为内参照，sYBRI荧光定量 RT．PcR检测肺癌患者的肿瘤组织相对其正常组织的爿尸C表达量。分 析研究4尸C甲基化状态与基因表达、年龄、，临床分期、病理分级、 吸烟史、预后的关系，结果用sPSs 13．O软件进行统计分析。 结果 测序结果显示阳性质粒所有cpG中的c保持不变，其余的c均 变为T。MSP反应体系的最佳M92+浓度为2．OmM，最佳引物浓度为 200 nM。MsP的敏感性为105拷贝／ml，其浓度对应的阳性质粒为弱 阳性质控品。 利用已建立的MsP方法，共检测了103份DNA标本的甲基化状 态，其中肺癌患者的肺正常组织阳性率为30．8％(12／39)，肿瘤组织 阳性率为66．7％(26／39)。l例硬化性血管瘤的肺组织、l例恶性淋巴 瘤病例的肺组织和14例正常人肺组织均无甲基化，另外4例门诊血 的淋巴细胞均无甲基化，3株肺癌细胞中NCI．H460阳性，而SPc—Al 和NcI—H446阴性。统计学分析显示：肺癌患者肿瘤组织的彳Pc基 因甲基化率高于相应正常组织，P=o．001。肺癌患者正常肺组织较正 常人肺组织爿Pc基因的甲基化率高，卢o．023。肺癌惠者肿瘤肺组织 较正常人肺组织彳Pc基因的甲基化率高，P-0．000。肺癌患者肿瘤纽 织相对其正常肺组织的爿Pc基因表达量为O．28l，88．0％的肺肿瘤组 织甲基化阳性标本的爿尸c基因表达降低，Jp=O．005。彳Pc基因甲基化 与年龄和预后之间有统计学意义。 结论 本研究建立了抑癌基因爿PC基因启动子lA序列的MsP检测技 术。构建了携带甲基化阳性的爿JpC基因启动子的质粒并制备了弱阳 性质控品，对MSP检测灵敏度进行质量控制，降低了检测的假阴性 率。肺癌细胞株H460的4Pc基因甲基化阳性，这在国内外尚未见报 道。 彳PC基因甲基化导致其表达降低，而表达的降低则导致wnt信号 通路和细胞骨架等的紊乱，这引发了细胞的癌变，导致肺癌发生，并 伴随着肺癌的进展，导致预后不良。4尸c基因甲基化随着年龄的增加 有增高的趋势；爿Pc基因在肺癌的发生和发展中发挥着重要作用； 爿尸c基因发生甲基化的病人预后不良。这些都提示彳Pc基因的甲基 化可能是肺癌早期诊断和预后的新分子标志物，其具有潜在的临床应 用价值。 关键词 DNA甲基化；表观遗传；4JDc基因；肺癌；甲基化特异性PcR； 质量控制