nr1抗原与tr融合蛋白真核表达质粒的构建.pdf

。 {Y1784786 NRl抗原与T依融合蛋白真核表达质粒的构建 摘 要 目的：N．甲基一D．天门冬氨酸受体(N．methyl．D．aspanate NR)与兴奋性突触传递、突触可塑性、学习和记忆等许多中枢活动密切相 关，其过度激活所介导的兴奋毒性与机体应激、药物成瘾性、疼痛、脑组 织继发损伤等有密切关系。通过选择性干预NR活动，可能为相关疾病提 供有效的治疗手段。己有的NR拮抗剂或阻断剂均为人工合成的小分子药 ．物，容易弥散通过血脑屏障，但作用选择性低，常引起意识模糊、焦虑不 安、幻觉等严重毒副作用，且存在难以超早期用药的问题，难以进入临床。 早期干预机体应激、脑损伤、药物成瘾、疼痛等的可行方法之一。转铁蛋 白受体(Transfemn 障，从而使得NRl抗原能够更好的在中枢神经系统发挥作用。因此，本研 究旨在用噬菌体展示技术预测小鼠NRl抗原表位，选择小鼠T依构建 NRl．T依融合蛋白真核表达载体，为NRl口服疫苗的制备做好前期准备。 方法：①用小鼠NRl单克隆抗体(Monclone ．融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白III上的随机十二肽，经过三 轮的生物筛淘后，从第三轮洗脱物中挑取所有56个噬菌体克隆，提取噬菌 NP sequence，CDS)，编号为GenBank chainreaction， 原表位优势序列，通过设计引物、聚合酶链反应(Polymerase 0【，氨苄青霉 达载体pcDNA3．1中，然后用氯化钙法转化到大肠杆菌DH5 素抗性筛选获得阳性克隆，扩增后提取质粒，进行肋船I和劢口I双酶切后 电泳，并进行生物测序鉴定。结果：经过3轮筛选后能与NRl单克隆抗体 特异性结合的噬菌体得到了有效富集，DNA测序结果表明56个单克隆噬 克隆噬菌体表达的氨基酸序列分别为： 体pcDNA3．1中，测序结果证明重组质粒载体插入序列与设计的靶基因片 段完全一致。结论：从噬菌体展示的随机十二肽库中成功筛选到了能与NRl 优势序列，可能模拟了天然抗原的某个表位。成功构建该优势序列与小鼠 实验奠定了基础。 关键词：N．甲基．D．天门冬氨酸受体；抗原表位；转铁蛋白受体抗体； 质粒载体；口服疫苗；应激 forNRl andTFR ofthe Plasmid Construction antigen Expression fhsion protein impoIrtallt receptor(NR)plays Abstract：objectiVe：N—methyl—D—aspaIrtate rolesinvarious as mnctions，such physiological synaptic formation and transmission， underlyingmemo叫 leamingduring synapse arealsoassociatedwithVarious