tlr4对大鼠出血后炎症反应和神经细胞凋亡的作用研究.pdfVIP

·中文论著摘要· TLR4对大鼠脑出血后炎症反应和神经细胞凋亡的作 用研究 目 的 脑出血是神经系统常见病、多发病，其致残率和死亡率均很高，严重影响人 类的健康和患者的生存质量。近年来，炎症反应在脑出血后继发性损伤中的作用 越来越受到重视，并认为它可能导致了脑出血后的细胞凋亡过程。目前脑出血后 炎症发生机制目前仍不十分清楚，其产生炎症反应的始动环节尚不明确。TLRs是 一个新发现的有高度保守序列而古老的天然免疫受体家族。TLR4作为膜受体“门 户”蛋白能够识别生物源性和非生物源性刺激，然后将信号传递给核转录因子NF —KB，启动和放大炎症反应，导致多种炎症因子的瀑布式释放，产生损伤效应。 本研究利用立体定向技术向大鼠尾状核内注入50uL自体股动脉血建立脑出血模 型，用TUNEL染色观察神经细胞凋亡，用免疫组化法检测脑出血后的血肿周围 脑组织TLR4、NF-K 周围脑组织TLR4 mRNA表达，旨在研究TLR4mRNA及蛋白是否在脑出血后血 肿周围脑组织表达及分布，从而探讨TLR4信号通路在脑出血后继发损伤(主要 指凋亡)中的作用研究。 材料与方法 一、材料 1、动物分组 正常对照组，n=10。 2、主要仪器 动物头颅立体定位仪、电子分析天平、图像分析仪、紫外分光光度仪、PCR 扩增仪、低温离心机、凝胶成像分析系统。 3、主要试剂 TLR4兔抗鼠多克隆抗体、NF—K Bp65兔抗鼠多克隆抗、Caspase．3兔抗鼠多 克隆抗体、二部法免疫组化检测试剂盒、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB试 PCR 剂盒、Trizol、RNAKit(AMv)、TLR4、引物、DNAMaker、DEPC、氯仿、 异丙醇 4、大鼠脑出血模型制作 用微量注射器抽取70uL大鼠自体股动脉血。立即将大鼠俯卧位于脑立体定位 鼠自体股动脉血50uL缓慢推注入脑。生理盐水对照组注入50uL生理盐水。正常 对照组不予任何处置。 5、标本制作 取各组5只大鼠于术后相应时间点麻醉开胸，迅速暴露心脏，4％多聚甲醛灌 注固定，取脑，样本置于4％多聚甲醛外固定4小时，酒精脱水，二甲苯透明，浸 蜡，包埋。连续冠状切片，片厚5um，进行切片HE染色和免疫组化染色。取各组 5只大鼠于术后相应时间点麻醉，断头取脑，置于Trizol中，--80℃冰箱保存，待 进行RT-PCR检测。 二、检测指标 1、TUNEL阳性细胞检测 切片滴加脱氧核糖核酸转移酶(TDT)和地高辛标记的dUTP反应液，37C (pU7．5)洗涤3min×3次；DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。显微图 像分析系统采集图像，分析阳性细胞积分光密度。 2、TLR4蛋白表达免疫组化检测 二步法进行TLR4蛋白表达阳性细胞测定。切片滴加50uL兔抗鼠多克隆TLR4 抗体(1：150)，4℃过夜，PBS洗3rain×3次；滴加一滴山羊抗兔IgG抗体一HRP多 聚体，各步骤用PBS洗3minX3次，DAB显色剂，苏木素轻度复染，脱水透明， 2 封片。显微图像分析系统采集图像，分析阳性细胞积分光密度。 3、NF．K B／p65蛋白、Caspase．3蛋白表达免疫组化检测 SABC法进行NF．K B／p65蛋白、Caspase．3蛋白表达阳性细胞测定。切片滴 加50uL一抗工作液(兔抗鼠多克隆NF．KB／p65抗体(1：400)、兔抗鼠多克隆 20min； minx 滴加SABC，37。C20rain，各步骤用PBS洗33次；DAB显色剂，木素轻 度复染，脱水透明，封片。显微图像分析系统采集图像，分析阳性细胞积分光密度。 4、TLR4 mRNA表达RT-PCR方法检测 酶的环境下提取总RNA后