血小板制品细菌污染核酸检测方法的建立和评价.pfg.pdfVIP

华东师范大学 血小板制品细菌污染核酸检测方法的建立和评价 院 系： 专 业： 方 向： 指导老师： 硕士研究生： 摘要 近几年来，随着输血引起的病毒感染风险的降低以及浓缩血小板制品 (platdet 受到越来越多学者的关注。国外研究表明单采血小板的细菌污染率为1：3000，混 合血小板的细菌污染率为1：2000，输注每单位血小板可能产生细菌感染的风险估 板输注后细菌感染引起败血症已成为发生几率最高、后果亦相对严重的感染性输 血风险。 3D全 目前，检测血小板制品中是否存在细菌污染的方法主要有BacT／Alert 自动细菌培养系统、Pall 3D全 自动细菌培养系统在发达国家得到了广泛应用，该系统敏感性高、结果可靠、操 作也相对简单。然而细菌培养的方法所需检测时问较长，检测成本较高，在实际 工作中开展仍有一定的困难，故我国目前尚未开展血小板细菌污染的常规检测。 近年发展起来的实时荧光定量PCR技术凭借其快速、灵敏度高等特点，被 国外一些学者引入到血小板制品细菌污染的检测中来。然而由于缺乏高效、简便 的细菌基因组DNA提取方法及有效控制反应体系中潜在细菌基因组DNA污染 的手段，致使核酸检测技术对血小板制品进行细菌筛查的方法仍不能有效的应用 于临床。 针对以上问题本研究从抽提方法入手，选取较难裂解的革兰氏阳性菌．金黄 色葡萄球菌作为实验菌株，分析比较五种经典的细菌基因组DNA抽提方法。结 果表明，在五种抽提方法中Chelex．100法抽提效率较高。为进一步提高其抽提 效率，本研究对Chelex．100法进行了改良，使其对细菌的最低检测下限达到 0．2CFUs／PCR(相当于10CFUs／m1)。 本研究针对细菌16s rDNA基因保守序列，设计了通用引物进行实时荧光定 华东师范大学 量PCR扩增，为降低检测体系中潜在的细菌基因组DNA污染对PCR检测灵敏 度和特异性的影响，本研究对PCR体系进行优化，利用MicroconYM．100离心 的细菌基因组DNA污染，降低了反应背景，使阴性对照Ct值大于34；同时依 4，经t检验证明两者结果有显著性差异(P0．001)。因此，可以看出双重过 滤法进一步提高了实时荧光定量PCR检测的特异性，在降低背景的基础上提高 了检测的灵敏度。 在建立起针对细菌核酸检测法的基础上，本研究对该检测体系的实用性进行 了评价。结果表明，在血小板制品常见污染菌株的检测中，该检测体系的灵敏度 同时与BacT／ALERT 3D全自动细菌培养系统的平行实验证明，经本研究优化的 实时荧光定量PCR检测法结果可靠，其灵敏度和特异性均为100％，K=1．000。 标本)临床标本的检测中，运用ROC工作曲线对结果进行分析，发现曲线下面 积为1．000，表明该检测方法对阳性标本的检出率高达100％，且重复性好，具有 较高的诊断价值。 除正常情况以外，细菌在外界因素的作用下会发生细胞壁缺损，同时又保持 原有致病性，称为细菌L型。临床上出现的许多慢性反复发作的感染基本上都 与细菌L型相关。由于L型细菌在低渗溶液中易裂解死亡，在普通培养检测系 统中往往发生漏检，这对血液安全产生潜在的威胁。为进一步评价本研究建立的 实时荧光定量PCR检测方法对细菌L型的检测，本研究成功地诱导出金黄色葡 萄球菌L型，并使用实时荧光定量PCR法在短时间内检测到L型细菌的存在， 提示我们该方法可以有效检测到血液制品中存在的L型细菌，为血液制品的安 全提供更好的保障。 实时荧光定量PCR检测法无论在操作步骤，检测时间或检测灵敏度及特异 性上都有很大优势，十分适用于血小板制品发放前的快速检测。虽然本研究目前 仅限于实验室研究阶段，尚未对大规模临床标本检测的可操作性、稳定性和可重 复性进行考核，但随着核酸检测技术逐步在血站传染病筛查中的应用，血液筛查 硬、软件条件的