psihbvx制乙肝病毒复制和表达的研究.pdfVIP

pSIHBV／X抑制乙肝病毒复制和表达的研究 摘 要 目的：利用重组DNA技术，构建能在体内转录产生针对乙型肝炎病 转录载体pSIHBV／X，将其与HBV1．3倍体真核表达质粒pHBVl．3共转染 DNA的变化，初步研究RNA干扰对HBV体外复制和抗原表达的抑制作 用。方法：根据siRNA的设计原则，以I-IBVl．3倍体全基因序列为模板， 与人类基因组无同源性。设计的两条寡核苷酸链分别为：上游序列5’ 间隔形成发夹结构，最后为siRNA靶序列的反向重复序列，3’末端加有 转录终止信号1]盯TT，两端分别含有Xho，和Xba1酶切位点。由生物公 司合成该序列。取等量的上、下游序列DNA合成片段，加入退火缓冲液 置于95℃水浴5分钟，缓慢降至30℃过夜，即得到退火的双链DNA，然 后进行双链DNA的纯化。含RNA聚合酶Ⅲ启动子的真核表达质粒 I和XbaI酶切后，暴露SalI和Xba，酶切 pTZU6+I经限制性内切酶Sal 位点，直接与纯化好的双链DNA定向粘端连接，即构建好转录针对x基 DNAssist I酶切位点消失， 2．0的分析，重组体pSIHBV／X如下特点：1．Sal 故不能被该内切酶消化，仍为环状质粒；2．XbaI位点存在，可被其切成 约3．2kb大小的线状DNA链；3．可被Hin卿＆以，切为2800 bp和 395 bp的两个片断。酶切后1％琼脂糖凝胶电泳结果显示重组体符合如上 特点，然后再将重组体提交给生物公司测序鉴定，结果证实重组体中含有 X基因转录体的发夹状 克隆的目的片断。至此，能在细胞内转录针对HBV siRNA转录载体pSIH]3V／X构建成功。 转染肝癌细胞株HepG2，同时设立感染对照组(只转染相同剂量的 h、48h、72 载体pSIGFP共转染)。转染后分别于24 h收集细胞上清液， 结果用实验孔吸光度(A)值／x寸照孔(A)值(S肘值，S表示待测样品， S／N值≥2．0为阳 N表示阴性对照)表示，I-meAgS／N值≥1．0、I-msAg 72 h时HBVDNA含量的变化，由计算机软件自动分析计算出定量结果， 采用计算机对数平均值的方法计算HBVDNA平均拷贝数；实验数据以夏 ±S表示，由SPSS10．0统计软件进行处理，多组间单因素方差分析得出P X基因的siRNA 果。结果：经酶切及测序证实成功构建了转录针对HBV 按l：1、l：20的不同比例共转染组，细胞培养上清液中HBVDNA的含 制是特异性的。具体结果为72 33％、40％(1：1时)和6l％、64％(1：20时)；HBVDNA分别下降了 用(PO．05)。结论：本实验利用基因重组技术成功构建了能在体内转 录产生针对乙型肝炎病毒x基因转录体的发夹状siRNA转录载体 HBV 复制和表达有显著和特异性的抑制作用。本实验为进一步深入探讨RNAi 关键词：RNA干扰；肝炎病毒，乙型；基因重组 effectRNAI of Inhibitory HBV-X Targeting on gene Bvirus Hepatitis all Abstra