第二章核酸分子杂交副本解析.pptVIP

与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点： 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。 RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。 RPA的缺点是需要同位素标记探针。 （三）引物延伸分析法（primer extension analysis） 可用于RNA 5’端的定位和定量，确定转录的精确起始。并可检测mRNA前体和剪接加工中间体。 待测RNA与过量的5’端标记的单链DNA引物杂交，随后用反转录酶延伸引物，合成与RNA互补的cDNA。通过变性的PAGE检测cDNA的长度，即可反映引物末端的标记核苷酸与RNA 5’端的距离。 * 尽管取得了上述重大进展，但分子杂交技术在临床实用中仍存在不少问题，必