蛋白质的双杂交技演讲稿解析.ppt

蛋白质的双杂交技术 演讲人：陈洁 2013.11.21 主讲内容： 蛋白质双杂交背景介绍 基因的功能是由蛋白质来执行的，蛋白质之间相互作 用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本 功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA 的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等 等，都离不开蛋白质之间的相互作用。因此，如果能够快 速做出蛋白质在不同时间、空间和不同环境中的相互作用 图谱，就会帮助我们了解这些蛋白质的功能，进而了解许 多生命活动的机制，双杂交系统是研究蛋白质相互作用的 有力工具。 2.酵母双杂交系统简介 酵母双杂交系统原理介绍 双杂交系统包括3 个基本的组成部分: ①表达诱饵蛋 白的载体, 诱饵即是我们感兴趣的蛋白, 它和DNA 结合结 构域融合。②表达靶蛋白的载体, 靶蛋白即是我们要寻找 的可以与诱饵相互作用的蛋白, 靶蛋白可以是一个已知的 蛋白, 也可以是cDNA 文库编码的蛋白. 同诱饵相似, 靶蛋 白和转录激活结构域融合。 ③一个或多个报告基因, 如 控制氨基酸合成的基因、位于DNA 结合结构域识别的调 控区下游大肠杆菌的lacZ 基因等, 。 真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参 与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： 酵母双杂交系统的工作原理： 酵母双杂交系统的建立得力 于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核 生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立 的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4， 在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域 (transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域 可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结 合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是， 单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不 能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一 起才具有完整的转录激活因子的功能。 酵母双杂交实验步骤概括 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交 蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的 蛋白质，其大致步骤为: 1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融 合，构建成诱饵质粒。 2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质 基本技术 诱饵融合表达质粒构建 融合表达cDNA文库构建 文库扩增，重组DNA收集 共转染 筛选 假阳性剔除 测序 生物学功能验证 具体演示流程 实验步骤 酵母双杂交系统使用注意事项 酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互 作用的有效和快速的方法，有多方面的应 用，但仍存在一些局限性。 某些诱饵蛋白具有自身激活性质。 ---------双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域 某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。 哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究 阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。 双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。 假阳性的去除 通过序列分析去除 质粒消除实验剔除假阳性 重新转化含有诱饵质粒的酵母株或不含诱饵质粒的酵母株，分析两种情况后去除假阳性 利用一个不相关的蛋白作为诱饵蛋白测试相互作用 两步或多步筛选 1) 检 测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。 2) DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。 3) 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。 4) 检测pGBT9对 照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1 x 105 colonies/mg DNA以上。