第五章目的基因的获取扩增与检测及相关技术之获取基因组文库修改简洁讲解.pptVIP

第五章 目的基因的获取、扩增 与检测及相关技术 1、物理化学方法 2、鸟枪法 3、化学合成法 4、基因文库 5、逆转录合成 6、 PCR技术 7、凝胶电泳 8、酵母双杂交系统 9、杂交技术 10、生物芯片 11、 DNA测序 第一节 目的基因的获取及相关技术 一、物理化学方法 二、鸟枪法 三、化学合成法 四、凝胶电泳 五、PCR技术 六、基因文库（基因组文库、cDNA文库） 七、逆转录合成 八、酵母双杂交系统 六、基因文库 1、基因文库的基本概念 2、基因文库的构建过程 3、基因文库中目的基因的筛选 1、基因文库的基本概念 是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。 根据构建方法的不同，基因文库分为： （1）基因组文库（含有全部基因） （2） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） complementary DNA（互补DNA） 克隆数的确定（基因文库的容量） 任一DNA序列在文库中出现的概率： N:该序列需要克隆的总数； p:任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，一般为99％；812674.78905768963633545194372407 I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb; G: 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp 将数据代入上式 = 8.1×105 N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在 8.1×105 以上时，才能以99％的概率得到此克隆。 2、基因文库的构建过程 （1）基因组文库的构建 （2） cDNA文库的构建 （1）基因组文库的构建 构建基因组文库时先提纯生物的总DNA，通过机械剪切或酶切使其成为一定大小的片段，连接到适当载体(常为?噬菌体)上，经体外包装转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。此即是基因文库。这群DNA片段含盖基因组全部基因。 噬菌体为载体的基因文库的构建 基因组文库的构建过程 ①生物基因组DNA的提取和片段化 ②载体的选择和制备 ③DNA片段和载体的连接 ④重组体转化宿主细胞 ⑤初库的扩增 ①生物基因组DNA的提取和片段化 用限制酶片段化： 1～3kb， 10～30kb 随机片段化：超声波（ 300bp ）、高速搅拌（ 8kb ） ②载体的选择和制备 ③DNA片段和载体的连接 ④重组体转化宿主细胞 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌 ⑤初库的扩增 柯斯质粒(cosmid)载体 基础：包含λ噬菌体cos位点的质粒； 导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞； 供体DNA大小：30-45kb。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105％所限制。 主要应用：基因组文库构建。 酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes, YAC) 基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS 导入宿主：转化酵母原生质体 供体DNA大小：2000kb 主要应用：大基因组分析 （2） cDNA文库的构建 cDNA文库是通过反转录mRNA，并制备双链cDNA(double stranded cDNA)来构建的。 克隆的重组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。 （2） cDNA文库的构建 ①总RNA的提取 ②mRNA分离纯化 ③逆转录合成双链cDNA ④cDNA的克隆 ①总RNA的提取 RNA ②mRNA分离纯化（亲和层析） ③逆转录合成双链cDNA ④cDNA的克隆 质粒载体构建cDNA文库 3、基因文库中目的基因的筛选 基因文库中目的基因的筛选 筛选DNA文库是分离目的基因常用的方法； 在成千上万的克隆中仅极少数含目的基因，且 大多数基因的产物不具有可选择的表型特征， 因此可采用以下策略来进行筛选： ①用特异探针进行分子杂交； ②用免疫和生化方法来检测基因产物； ③用特异性引物进行PCR扩增。 ①用特异探针进行分子杂交 分子杂交（molecular hybridization）： 探针（probes）:根据所需基因的核苷酸顺序制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记。 ②用免疫和生化方法来检测基因产物 免疫法检测基因 生化方法检测基因（如酶活性法） 用免疫的方法分离克隆的目的基因 ★用靶蛋白制备抗体 ★用这种抗体制备抗抗体，一扩大信号。 ★标记抗抗体； ★进行免疫实验。 ③用特异性引物进行PCR扩增 七、逆转录合成 利用逆转录酶由mRNA逆转录合成基因的方法，主要用于合成分子量较大而不知其序列的基因。与cDNA文库方法类似。