第三节核酸的理化性质分析.ppt

第三节 核酸的理化性质 一、核酸的一般性质 1. 状态： 核苷酸为无色晶体或粉末, DNA为白色纤维状固体， RNA为白色粉末。 2. 分子大小： 核苷酸分子量： 1bp ? 618D. DNA和RNA皆是高分子量物质。 DNA分子粘度要比RNA大得多。 粘度大小：线性分子 不规则线团 球形分子 变性DNA粘度下降。 4. 溶解性： 5. 特殊颜色反应 6. 旋光性: 二、核酸的水解 1. 酸水解: 2. 碱水解 三、核酸的酸碱性质 DNA和RNA分子也是两性电解质。 四、核酸的紫外吸收 嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，所以碱基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸收，最大吸收峰在260nm处。 五、核酸的变性、复性与杂交 （一）变性（denaturation） 1. 热变性 （二）复性（renaturation） （三）杂交（hybridization） * DNA、RNA微溶于水，不溶于一般有机溶剂。 核酸钠盐比游离酸易溶于水。 3. 粘度： （1）地衣酚法定性、定量鉴定RNA: （2）二苯胺法定性、定量鉴定DNA: 绿色物质 D-核糖 + 浓盐酸 + 地衣酚 FeCl3 100oC, 20-30′ （?670nm比色） D-2-脱氧核糖 + 酸 + 二苯胺 加热 蓝色物质 （?595nm比色） 冰醋酸，少量浓硫酸 （3）核酸的溴化乙锭（EB）染色 EB是一种荧光染料，可插入核酸相邻碱基对之间。在紫外灯下，结合EB的核酸呈橙红色荧光。灵敏度为10ng。 GoldView (GV)是 溴化乙锭（EB）的新型替代品，灵敏度与EB 相当，但无致癌作用。 核酸分子是高度不对称的，具旋光性。 核酸变性，比旋值下降。 DNA的比旋值 [?]D = + 150°（右旋） RNA可被碱水解为核苷酸。DNA不具2′-OH, 不能形成碱水解的中间物，所以DNA抗碱。 糖苷键和磷酸酯键皆可以被水解。 稀盐酸可水解嘌呤糖苷键; 水解嘧啶糖苷键需要高温和强酸条件（甲酸等）。 Fig. 4-29 Hydrolysis of RNA under alkaline conditions. 3. 酶水解： 磷酸二酯酶 (phosphodiesterase) （非特异性水解磷酸二酯键） 蛇毒磷酸二酯酶：产物为5?- 核苷酸 牛脾磷酸二酯酶： 产物为3?- 核苷酸 Fig. 4-30 Snake venom phosphodiesterase and spleen phosphodiesterase are exonucleases that degrade polynucleotides from opposite ends. 蛇毒磷酸二酯酶 牛脾磷酸二酯酶 核酸酶（nuclease）（特异性地水解核酸） 核糖核酸酶 脱氧核糖核酸酶 如：牛胰核糖核酸酶（ RNaseⅠ） 核糖核酸酶T1 如：牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ） 牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅱ） 限制性核酸内切酶 核酸内切酶 核酸外切酶 根据底物： 根据作用方式： Fig. 4-31 An example of nuclease specificity: The specificity of RNA hydrolysis by bovine pancreatic Rnase （RNaseⅠ）. RNaseⅠ：产物为3′- 嘧啶核苷酸或以其为尾的寡核苷酸 Fig. 4-32 Nuclease specificity: Cleavage in polynucleotide chains: a cleavage yields 5’-phosphate products, whereas b cleavage gives 3’-phosphate products. a: DNaseⅠ，产物为5′- 核苷酸或以其为尾的寡核苷酸 b: DNase Ⅱ，产物为3′- 核苷酸或以其为尾的寡核苷酸 核苷酸含有磷酸基团和碱基，是两性电解质。 在pI处，核苷酸以兼性离子存在。 多核苷酸中，磷酸基pK1′=1.5，因其酸性较强，所以核酸表现为酸性。 Fig. 4-33 The absorption spectra of the common nucleotides and their molar absorption coefficients at 260 nm and pH 7.0. （1）定性定量鉴定各种核苷酸 （2）核酸纯度鉴定 纯DNA: A260 / A280 1.8