第四章电泳法讲解.ppt

第四章 电 泳 电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。三大要素：带电颗粒、电场、溶液。 电泳技术发展简史 1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 电泳可分为三大类： 显微电泳 自由界面电泳 区带电泳 1．显微电泳 它通过显微镜直接观察分散于液相介质中的微粒在电场中的移动方向和速度，验证微粒表面电荷的符号和密度，进而推测它们的组成和特点。 2．自由界面电泳 是胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后，在胶体溶液和溶剂之间形成界面的电泳过程。 最简单的界面电泳是在一“U”形管中装入一定量的带色胶体溶液如黄色硫化砷胶体溶液或血红蛋白溶液，然后小心地分别在U形管两端注入等量的稀电解质溶液(NaCl溶液或一定pH的缓冲液)，使其与胶体溶液之间有明显的界面，接着在此管两端放入铂电极，通直流电，过一段时间即可看到—边胶体溶液的界面上升，另一边则下降。这是胶体颗粒产生泳动的结果。由于该电泳不受支持物的影响，所以分离效果较好，一般适用于胶体物质的纯度鉴定及电泳速度的测定。 3．区带电泳 是样品物质在一惰性支持物上进行电泳的过程。因电泳后，样品的不同组分可形成带状的区间，故称区带电泳，亦称区域电泳。 采用不同类型的支持物进行该电泳时，能分离鉴定小分子物质(如核苷酸、氨基酸和肽类等)和大分子物质(如核酸、蛋白质，以及病毒颗粒等)。优点：1）由于区带电泳有支持物存在，能减少了界面之间的扩散和异常现象的干扰发生，某些支持物具有分子筛的效能，区带电泳的灵敏度和分辨率可以提高。2）区带电泳设备简单、操作方便，已成为开展生物化学和分子生物学等研究工作的一种不可缺少的工具。 第一节 基本原理 当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场时，便有一个力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒净电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可用下式表示： F＝E·q由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力（f·v)阻挡，当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前流动。 v=F/f=E·q/f式中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即 f＝6∏rη 式中r为颗粒半径，η(Eta)为介质粘度。该公式系指球形颗粒所受的阻力。把f公式代入v公式得： V= E·q/6∏rη 从公式可知，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质粘度成反比。若颗粒是具有两性电介质性质的蛋白质分子时，它在一定pH溶液中的电荷性质是独持的。这种物质在电场中泳动一段时间后，便会集中到确定的位置上呈一条致密区带。若样品为混合的蛋白质溶液时，由于不同蛋白质的等电点和分子量是不同的，因此经电泳后，就形成了泳动度不同的区带。利用此性质，便可把混合液中不同的蛋白质(或其它物质)分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。 泳动度(m)或迁移率是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度。也可写成下列公式： 式中d为带电颗粒泳动的距离(cm)；l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(秒)；V为加在支持物两端的实际电压(伏特)。在一定的条件下，任何带电颗粒都具有自己的特定泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质等，还可用其研究蛋白质、核酸等物质的一些化学性质。影响泳动速度的因子有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质等。 影响电泳的因素 六大因素 1．颗粒性质 颗粒直径、形状以及所带的静电荷量对泳动速度有较大影响。一般来说，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，