课题__多聚酶链式反应扩增DNA片段讲解.pptVIP

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 DNA复制方向示意图 DNA变性和复性示意图 Taq DNA聚合酶的应用 DNA聚合酶的特性，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链、而不能从头合成DNA 高温导致DNA聚合酶失活 课题2“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”Taq细菌的发现过程 PCR的反应过程 一般采用变性-复性-延伸三步循环。 ⑴变性：将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到95℃，使双螺旋DNA解开成为单链。 ⑵复性：通过降低反应温度至55℃，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3`端粘合。 ⑶延伸：将反应温度提高到约72℃，在耐热DNA聚合酶的催化下，合成两条互补链，从而使模板DNA扩增一倍。按照上述步骤重复操作约30次，即可将模板DNA扩增数百万倍。 三、实验步骤： 注意事项：详见操作提示 * * * * PCR技术简史 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 PCR原理细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件 DNA复制的知识 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（ RNA） 打开DNA双链 模板 合成子链原料 催化子链合成 使DNA聚合酶能从引物3’端开始连接脱氧核苷酸 思考：体内DNA复制的条件是什么？ DNA的合成方向 DNA双链的方向，区分 DNA的3′端和5′端 PCR技术与体内DNA复制的区别： 1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要； 2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性； 3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。 准备好PCR反应体系的配方 用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分 盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液 离心10分钟 将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应 四、结果分析与评价 DNA 含量的测定：稀释→对照调零→ 测定→计算（公式见P63） 波长260nm处读数 蒸馏水做对照 50倍 练习巩固 1、关于PCR技术的应用，错误的一项是 A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定 B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学 C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘ D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定 2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？ 3、PCR技术最突出的优点是 A 原理简单 B 原料易找 C TaqDNA聚合酶有耐热性 D 快速、高效、灵活、易于操作 4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染 C 高压灭菌 D 在—20 ℃储存 * *