恒定磁场对大鼠骨髓基质干细胞成骨的影响及其作用MG63细胞验证无镍不锈钢生物相容性研析.pdf

摘要： 目的：实验第一部分：首先利用稀土磁铁钕铁硼在实验室条件下构建一个恒 定磁场，采用全骨髓培养法分离培养大鼠的骨髓来源基质干细胞，经过表面标志检 测后，传代扩增，将一部分基质干细胞接种于直径3．5cm培养皿中，然后将接种了 基质干细胞的培养皿分为两组，第一组采用药物来诱导基质干细胞成骨的方法，即 使用成骨条件培养基(含10％胎牛血清的DMEM培养基中加入0．1uM的地塞米 松，lOMmB一磷酸甘油钠，0．2mM的维生素C)。将大鼠的骨髓基质干细胞向成骨细 胞诱导。另外一组首先加入与第一组相同的药物诱导成骨培养基，之后将培养皿 放在细胞培养箱的稀土磁铁钕铁硼上，每天放置12小时使其在恒定磁场下暴磁， 之后将其放入另外的细胞培养箱中培养。两组细胞分别连续培养7天，在l、3、 5、7天分别取出两组细胞进行细胞形态光镜观察，用MTT法进行细胞增值检测， 碱性磷酸酶表达水平检测，细胞VonKossa染色，第七天进行细胞爬片的扫描电镜 观察。比较两组细胞成骨能力的不同，进而评价恒定磁场在大鼠基质干细胞体外 成骨诱导中的作用。同时，将另外一部分基质干细胞接种与金属钛表面，将接种 了基质干细胞的钛片放入直径3．5cm的培养皿中，同样分为两组，一组加入药物 诱导成骨培养基，另外一组在加入药物诱导成骨培养基的同时按照同样方法进行 周期性的磁场刺激。在接种基质干细胞24h后，检测两组钛片表面的细胞粘附率， 在连续培养7天后，对两组钛片表面进行碱性磷酸酶染色和扫描电镜观察，比较 两组细胞成骨趋势的不同，进而评价恒定磁场对于钛表面生长的基质干细胞的成 骨作用的影响。实验的第二部分是使用14663细胞系来检测新型生物材料无镍不锈 钢的生物相容性。首先培养扩增MG63细胞，之后将M663细胞分别接种于无镍不 培养基，在开始培养12小时后检测三种金属表面的细胞粘附率，在培养的1，3， 5天进行枷fT检测，碱性磷酸酶检测，金相显微镜观察，比较三中金属生物相容 性的不同。 方法实验一所需要的恒定磁场由稀土磁铁钕铁硼产生，首先与中国科学院 金属研究所合作测定实验所用的稀土磁铁钕铁硼的磁场强度，将稀土磁铁钕铁硼 用75％的乙醇浸泡20rain．风干后于紫外线照射30min．保持无菌状态移入细胞培 4 养箱，过夜后备用。由中国医科大学实验动物中心提供的四周龄SD大鼠(雌雄不 限)，脱颈处死后浸泡于75％的酒精中30rain。无菌取出大鼠的双侧股骨，尽量去 除软组织，用无菌剪刀剪除两端，用含10％胎牛血清的蹦脚冲洗骨髓腔，所得 的液体经过200目筛网，收集液体接种于25cm2培养瓶中，放入细胞培养箱中，5 ％C02、37℃。24小时后换液，首次换液禁用PBS缓冲液洗涤细胞，轻轻倒出原培 养基，小心注入新鲜培养基。倒置显微镜观察，当细胞接近与75％相互接触时， 进行细胞传代。一般4-5天传代，传代比例为l：3，取前两代细胞进行细胞表面 抗原检测，对基质干细胞进行鉴定。当细胞扩增到所需数量时，即可着手准备对 细胞进行诱导和相关检测了。首先将培养瓶中的培养基倒掉，PBS缓冲液洗涤细 胞，加入2．5％的胰蛋白酶5ml消化5rain(此过程在光镜监视下完成)，轻轻倒掉 胰蛋白酶，加入2ml培养基反复吹打，收集液体于离心管中，1000r／min离心5rain． 弃去上清，2ml培养基重悬细胞，细胞计数板细胞计数，调整细胞密度为4X107ml， 接种于3．5cm培养皿2ml。1天后换液，3天后再次换液，5天后光镜下检查培养 皿，选择细胞生长均匀，形态良好，无大片空白区或重叠生长的培养皿为本实验 选材。将经过筛选的培养皿随机分为两组，，第一组采用药物的基质干细胞诱导成 骨方法，即在含10％胎牛血清的DMEM培养基中加入0．1ull的地塞米松，10棚B一磷 酸甘油钠，0．2mM的维生素C．将大鼠的基质干细胞向成骨细胞方向诱导。另外一 组首先加入与第一组相同的药物诱导成骨培养基，之后将培养皿放在细胞培养箱 的稀土磁铁钕铁硼上，每天放置12小时，之后将其放入另外的细胞培养箱中培养。 两组细胞分别培养7天，在l、3、5、7天分别取出两组细胞进行细胞形态光镜观 察并且照相，在相同的时间点上，将两组细胞浓度调整为lxl04／ml，并接种在96 孔板中，每孔加20ul的M1．．I．，置于37℃培养箱中孵育4小时取出，吸除培养基后 每孔加150ul的二甲基亚砜10分钟后充分震荡，置酶标仪上选择490hm波长测 0D值。每次实验重复五次。同样在相同时间点