基因工程的工具酶概述.ppt

3 基因工程工具酶Instrumental enzyme of gene engineering 掌握：工具酶的特性和用途 1. 限制性核酸内切酶 2. DNA连接酶 3. DNA聚合酶 4. DNA修饰酶 重点：限制性核酸内切酶、DNA连接酶特性和用途 难点：限制性核酸内切酶、DNA连接酶特性和用途 3.1 限制性核酸内切酶 2、识别序列的对称性: 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。 3、切割位点的规范性: 双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。 3.1.4 限制性内切酶的切割方式限制性核酸内切酶－“分子手术刀” “切哪里”? 练一练 3.1.6 同裂酶和同尾酶 同裂酶（isoschizomer）：是指来源不同的但却具有相同的识别序列，切割DNA后产生相同末端（或不同末端）的一组限制酶。 Kpn I 5’……GGTAC C……3’ Asp 718 5’……GGTAC C……3’ Xma I 5’…… C CCGGG ……3’ Sma I 5’…… CCC GGG ……3’ 同尾酶（isocaudamer）：是指来源不同、识别序列也不同但切割后产生相同的粘性末端一类限制酶。 3.1.8 影响限制性内切酶活性的因素 DNA纯度 DNA的甲基化程度 DNA的分子结构 限制性核酸内切酶的缓冲液 酶切消化反应的时间和温度 反应体积和甘油浓度 练习题 为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。 是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。 OH P × × 是相邻的－因此不能封闭gap，只能封闭nick. DNA 连接酶连接的作用机制 ⑴ E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi E(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN ⑵ E－AMP ＋DNA＝DNA－AMP＋E ⑶ DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。 衔接物缺点 在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。 大肠杆菌三种DNA聚合酶特性比较 大肠杆菌聚合酶Ⅰ的应用示例 缺口平移：双链DNA的单链缺口在DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’外切作用下，从缺口的5’端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用缺口的3’端游离羟基逐个加上相应的单核苷酸，使得缺口向下游移动。 总结 3.5 核酸探针的标记 (gene probe) 核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记物标记的，能与特定的靶分子发生特异性相互作用的DNA或RNA片段。 分类 基因组DNA探针；病毒DNA等 cDNA探针（最常用） 寡核苷酸探针：10-50bp RNA探针 探针的标记物 理想的标记物：敏感度高；特异性强；不影响探针分子的主要理化特性；标记、检测方法简单、保存时间长；对环境无污染、对人体无损害；价格低廉。 分类 放射性标记物 非放射性标记物 将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。 常用于标记探针的标识物： 同位素：32P , 35S , 3H-dNTP等； 非同位素：地高辛-dNTP ，生物素-dNTP。 缺口平移或切口平移 Nick Translation 随机引物标记探针 末端标记法 T4多核苷酸激酶法 内切酶 大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途 A. 制备DNA探针 利用其3′--5′的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于DNA连接后的大缺口填充 利用5′--3′的聚合酶活性。 C. 用于DNA的序列分析 利用5′--3′的聚合酶活性。 Klenow片段 Klenow片段大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→ 5 ′的核酸外切酶活性，但