基因工程的基础知识与基本技术概述.ppt

基因工程基础知识与基本技术 基因工程基础知识 基因工程的基本技术 基因工程基础知识 1 基因及基因的结构特点 什么是基因？ 基因是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位。 根据这个概念，一个基因不仅含编码蛋白质肽链或RNA分子的核酸序列, 还包括保证转录所必需的调控序列及位于编码区上游5’端的启动子非编码序列、内含子（intron）和位于编码区下游3’端的终止子非编码序列。 前者的编码区是基因功能发挥的结构基因（或功能基因），而后者起调控启动，终止的非编码区属于调控基因。 基因学说的发展 1953年，Watson与Crick创立DNA双螺旋结构模型 A＝T　G≡C 既然DNA分子是基因的载体，那么是否每一段DNA都是基因呢？ 1.1 基因的结构特点 共同特点 基因都是由基因结构序列和调节序列组成 　　 调节基因包括：启动子、增强子、终止子等 原核生物基因的结构特点 原核生物的绝大多数DNA分子都用于编码蛋白质(生物化学，P505）； 功能相关的RNA和蛋白质基因多集中在基因组的一个或几个特定部位，形成功能单位或转录单元(生物化学，P466） ； 尽管重叠基因的DNA序列大致相同，但基因重叠部位一个碱基的变化变可以影响后续肽链，编码完全不同的蛋白质 多顺反子：编码多个蛋白质的mRNA 多顺反子是一组相邻或相互重叠基因的转录产物，这样的一组基因被称为一个操纵子 SD序列：起始密码子的上游7-12bp处的一段序列，在与16S核糖体的结合过程中起作用 真核生物基因的不连续性：外显子、内含子、连接区 中心法则 基因工程的基本操作技术及原理 核酸的凝胶电泳 PCR技术 分子杂交 基因突变技术 1 电泳技术 生物大分子在电场作用下在凝胶中的运动。 琼脂糖电泳 DNA、RNA的分离、分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳　　蛋白质及小分子质量的DNA的分析与纯化 普通琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.1 电泳迁移率与生物大分子属性的关系 分子的大小 所带电荷的多少 构型或形状的差异 1.2 电泳迁移率同凝胶及浓度的关系 凝胶类型：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺 凝胶浓度：高、低 ? 天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。???? 1.3 电泳迁移率与电场的关系 在一定电场中，电压越高，电泳速度越快； 随着电压的升高，不同长度的DNA流动泳动的增加程度不同，因而凝胶的有效分离范围反而下降 1.4 染料 EB: 溴化乙锭 Goldview SYBR Green I 2 PCR (polymerase chain reaction) 技术 PCR技术产生背景 1958年，DNA聚合酶（polymerase)分离 1976年，Chien分离出热稳定的聚合酶 1983年，Mullis建立了PCR的反应过程，并获得了诺贝尔奖 1986年，分离出适用于PCR的Taq热稳定聚合酶 人工合成寡核苷酸方法的发展与成熟 ①变性 变性不完全：导致PCR失败，未完全变性的双链DNA会很快复性，减少DNA产量； 变性时间过长或温度过高：导致聚合酶活性下降，扩增效率降低 Taq酶活性的半衰期为：92.5度130 min; 95度40 min; 97度5min ②退火 引物退火的温度和所需时间取决于引物的碱基组成、引物的长度，引物与模板的匹配程度及引物的浓度。 退火温度越高，所得产物的特异性也越高 实际使用的退火温度双扩增引物的Tm值低5-10度 退火温度的选择 两条引物间的Tm值相差小于5℃，最好1℃。 退火温度以两条引物中Tm值较低的为准，并且低5-10 ℃ Tm=（A+ T）X2+（C+ G）X4 退火温度=Tm-(5-10) A T C G指引物与模板直接配对的部分，外加碱基不算 Tm=69.3+0.41*(G+C)/N*100-650/N ③延伸 　延伸反应通常在72度进行，接近Taq酶的最适温度75度。 　在一般反应体系中， Taq酶每分钟可以合成约2kb长的DNA片段。 　在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延伸时间，减少Taq酶活性的损失。 ④循环次数 当其他参数确定后，循环次数主要取决于模板DNA的浓度。 一般来说，循环次数25－35轮已足够。循环次数过多，会使PCR产物严重出错，非特异性产物增加。 2.1 PCR反应程序 2.2 PCR反应成分 （1）引物 DNA聚合酶需要一小段双链DNA