小鼠腭裂相关基mcpr1功能的研究.pdfVIP

中文摘要 小鼠腭裂相关基因mcprl功能的研究 摘 要 目的：本实验室克隆的小鼠腭裂相关基因1(MouseCleft PalateRelated 录并命名，其前期研究鉴定了mRNA全长，初步建立了mcprl 组织表达图谱，并探讨了这个基因在颌面部发育中的时空表 达，成功构建了mcprl的绿色荧光真核表达载体，制备了 mcprl多克隆抗体。但是，对mcprl的功能仍有许多未知之 处，在本实验研究工作中，我们从该基因编码蛋白MCPRl 在小鼠胚胎发育不同时期的表达变化；亚细胞定位；过表达 与抑制表达对小鼠腭突问充质细胞(MEPM)生物学特性的 影响；mcprl与维甲酸(RA)的关系等方面对其功能做了初步 的分析。为进一步深入地研究该基因的功能和相应蛋白的功 能奠定基础。 方法：@mcprl在小鼠胚胎发育中的表达研究取妊娠 12、14、18天的C57BL／6N近交系孕鼠引颈处死，取出胎鼠， 置于40玑多聚甲醛中4C固定24h，胎鼠侧面部朝下石蜡包 埋，制备59m厚连续切片。免疫组化检测，观察mcprl的蛋 白表达情况。(Dmcprl的亚细胞定位研究取妊娠第12．5天 条件下取出胚胎，放在PBS中，在显微镜下分离腭突。用组 织块法进行原代培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，待细 胞生长密度接近80％，O．25％胰酶消化，传代。取第3代的 细胞爬片，按免疫组化检测试剂盒所示程序进行免疫组化染 中文摘要 色。以角蛋白、S．100蛋白和波形蛋白多克隆抗体为一抗， 鉴定细胞来源。培养5代后用于实验。提取MEPM细胞胞 浆蛋白和胞核蛋白，采用本实验室制备的mcprl多克隆抗体， 应用Western Blot技术检测mcprl在胞浆及胞核中的表达以 胞生物学特性的影响 利用前期实验构建的 采用脂质体介导方法，按照invitrogen公司产品说明书的方 法用Lipofectamine 同时设空载体转染组和空白对照组，MTT法检测转染后细胞 孔板后，随机分为RA诱导正义转染组(A组)、RA诱导反义 转染组(B组)、RA诱导未转染组(C组)、正常对照组(D组)。 各诱导组加入1×l旷8 mol／L浓度的ATRh(用无水乙醇稀 释)，对照组加入同等剂量的无水乙醇。MTT检测各组细胞 改变：流式细胞仪检测细胞周期变化。 结果：①免疫组化结果显示MCPRl在小鼠胚胎多组织 的发育中呈现不同的表达模式，在E14时，Meckel软骨内有 少数MCPRl阳性表达细胞，软骨周围阳性细胞较多；在E18， Meckel软骨内MCPRI阳性表达细胞增多，且前部较后部多。 中文摘要 Blot结果显示在胞浆蛋白中MCPRI阳性条带明显，而胞核 蛋白中无明显阳性条带。③Mrr检测结果显示反义转染组 MEPM细胞增殖活性明显高于正义转染组和空白对照组；流 式细胞仪检测结果显示反义转染组MEPM细胞处于S期、 G2及M期的细胞比例明显高于正义组及空白对照组，具有 显著差异。表明反义表达载体转染后处于DNA合成期及合 成后期的细胞显著增多。④Mar检测结果显示B组细胞增 殖活性与D组差异无统计学意义。流式细胞仪检测结果显示 B组处于S期、G2及M期的细胞比例与D组无显著性差异。 Western 达较强，在B组中最弱。 结论：①推测mcprl在颅神经嵴细胞成骨过程中可能以 促PCD基因的身份在软骨细胞的移行中发挥作用；在胚眼 发育中的时空表达变化提示mcprl可能在视泡的形成及晶状 Blot 体等眼部结构的发生发展中起着一定的作用。②Western 结果说明mcprl的蛋白表达产物定位于细胞浆，mcprl蛋白 属胞浆蛋白，与生物信息学预测及前期实验原位杂交结果及 细胞免疫组化染色结果相一致。亚细胞定位的进一步明确， 为后续研究致畸剂如维甲酸作用下MEPM细胞内mcprl的 表达变化，以及封闭meprl后MEPM细胞生物学行为的改 变提供实验依据。为进一步研究该蛋白的功能打下了坚实的 核表达载体的转染证明了mcprl的反义真核表达载体可以在 蛋白水平有效的封闭mcprl的表达，表明反义真核表达载体 封闭效果的可靠性，更