牛牙周膜细胞生学特性及中药双黄补对该细胞增殖影响的体外研究.pdfVIP

中 文 摘 要 牛牙周膜细胞生物学特性及中药双黄补对该细胞 增殖影响的体外研究 摘 要 目的:牙周病治疗的根本目标是牙周组织再生，包括形 成新的牙槽骨、牙骨质和牙周膜。牙周组织完全再生有赖于 牙周膜细胞的增殖和分化。体外培养牙周膜细胞(periodontal ligamentcells,PDLCs)是目前研究牙周生物学特性以及利用 牙周膜细胞进行体内移植研究的重要手段。由于牙周膜独特 的解剖结构和取材的数量限制，获得足够的实验用细胞或种 子细胞仍然很难。本实验体外原代培养新生牛牙周膜细胞， 观察该细胞生物学特性，旨在寻找合适的种子细胞，探讨将 该细胞应用于牙周组织工程的可行性，为建立牙周组织工程 动物模型及进一步进行牙周组织工程实验研究奠定基础。 牙周组织再生过程能否顺利进行，关键在于牙周膜细胞 的增殖分化活动是否旺盛。在前期动物实验及临床研究中我 们发现中药双黄补有显著的抑菌消炎、促进牙周组织再生作 用。本研究观察不同浓度及不同时间双黄补对牛牙周膜细胞 增殖作用的影响，摸索双黄补的最佳作用浓度及有效作用时 间，为将来体外构建中药双黄补一牙周膜细胞一高分子支架 材料复合体，植入牙周缺损区的思路提供可靠支持。 方法:采用组织块法分离培养新生牛牙周膜细胞，测定 其贴壁率、生长曲线、分裂指数等基本生物学特性，制备中 药双黄补煎液，观察双黄补对该细胞的增殖活动的影响。 1新生牛牙周膜细胞的分离培养:选取在出生后12la内处死 中 文 摘 要 的纯种雄性荷兰花牛，拔取已萌出的8颗下领牙，刮取根中 1/3的牙周膜组织，采用组织块法培养牙周膜细胞。 2牛牙周膜细胞贴壁率的测定:取第3代细胞胰酶消化，制成 细胞悬液，调整细胞浓度至1X106/ml。接种于24孔培养板， 分别于2,4,6,8,10,12,1411取4孔，吸弃培养液，胰 酶消化，计数，计算贴壁率。 3牛牙周膜细胞生长曲线绘制:取第3代细胞胰酶消化，制 成细胞悬液，调整细胞浓度至5X103/ml。接种于24孔培养 板，每24h取3孔，吸弃培养液，胰酶消化，计数，取均值。 连续观察7d，绘制生长曲线。 4牛牙周膜细胞分裂指数测定:取第4代生长状态良好的细 胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1X104/ml。接种于预先 放置盖玻片的6孔板中。每24h取出1张盖玻片。Hanks液 冲洗，95%乙醇固定，HE染色。镜下取细胞数多、中、少各 一个区计数 1000个细胞中的分裂相，取平均值，计算所占 百分比，连续记录6d口 5中药双黄补煎液的制备:将黄连、黄琴、骨碎补按一定比 例混合，煎煮过滤，浓缩，醇沉，活性炭脱色，过滤除菌。 用含1%FBS的培养液稀释到相应终浓度。调pH至7.0-7.1, 分装，4℃保存备用。 6中药双黄补对牛牙周膜细胞的增殖效应:取第4代细胞悬 液，接种于%孔培养板，孵育24h。吸弃培养液，随机分组， 分别加不同浓度的中药双黄补，继续培养72h后，采用四哇 盐比色法(MTT)于酶标仪上492nm处读取A值，得出最佳 作用浓度。在该浓度下测定不同时间的细胞增殖情况，测定 有效作用时间。 - ， ~ 钾 一 目一 目户一 .，目目.，..，川.~ 一 . ~ 叫叫，， 2 中 文 摘 要 结果 1木次牛牙周膜细胞原代培养成功率为 100%。倒置相差显 微镜下观察3-5d有细胞从组织块周围游出，放射状排列。 15d细胞长满培养瓶底。 2牛牙周膜细胞传代接种后，首先在培养液中呈悬浮状态。 15-30min后，少数细胞开始伸展。6h后，细胞贴壁率达 25.8%a14h后，细胞贴壁率为80.6%a24h，细胞交织成网 状。 3新生牛牙周膜细胞的生长曲线略呈 “S”形。接种后第 1d 细胞数略有下降，第2d开始有所回升，第3d开始曲线急 剧上升并持续至第5d。第6d开始进入平台期。 4新生牛牙周膜细胞 6d的分裂速度时快时慢，分别从 2.89%一11.66%不等。 5各浓度中药双黄补组的牛牙周膜细胞生长速度均高于对照 组，双黄补煎液在浓度为100ag/ml时对牛牙周膜细胞增殖 效果最为显著。接种后