利用RNA干扰术研究PARP1在氢醌细胞毒性及DNA甲基化过程中的作用.pdf

利用RNA干扰技术研究PARPl在氢醌细胞毒性和DAN甲基化过程中的作用 I在 利用RNA干扰技术研究PARP 氢醌细胞毒作用和DAN甲基化过程中的作用 专 业：卫生毒理学 博士生：沙焱 导 师： 庄志雄教授 中山大学公共卫生学院 中文摘要 聚ADP核糖化是细胞在对内外环境的遗传毒物刺激的应答过程中对蛋白质进 行翻译后修饰的一种机制，催化此过程的酶即聚ADP一核糖聚合酶 能，如DNA修复、细胞增殖、细胞死亡、染色质功能及基因组稳定性。PARP是一 个由18个成员组成的超家族，其中PARPl是最主要的成员之一，负责催化完成细 胞内60％以上的聚ADP核糖化过程。PARPI是细胞内最早对DNA损伤做出反应的 蛋白之一，尤其对于DNA断裂的反应十分灵敏。人以R尸J基因位于1号染色体 excision 的q臂，共有23个外显子组成。碱基切除修复(baserepair，BER)是机 体一种主要的修复系统，而PARPl是此系统中主要修复因子之一，在DNA损伤 修复中发挥着重要的作用。PARPl与人X线修复交叉互补基因1(x—rayrepair cross 13)、DNA连接酶III complementinggroup1，XRCCl)、DNA聚合酶B(Pol Q)、和脱碱基内切核酸酶(APE)结合形成复合体，而且多聚核苷酸激酶 (Li93 (PNK)相互作用，发挥重要的支架蛋白的作用，参与碱基切除修复和DNA单 1,DNMTl)能够发生免疫共沉淀反应，DNMTl结合了长而分支 methyltransferase 的ADP．核糖多聚体以后，其催化DNA发生甲基化的活性也被相应抑制。本研究 将利用RNA干扰技术特异性抑制人支气管上皮细胞(HBE)中PARPl的表达， 在此基础上探索PARPl在DNA修复与DNA甲基化两方面的作用。 氢醌(HQ)是苯的一种代谢产物，其可引起DNA的烷化损伤和断裂损伤，它 一夕一 利用RNA干扰技术研究PARPl在氢醌细胞毒性和DAN甲基化过程中的作用 所导致的DNA损伤是通过碱基切除修复(BER)途径进行修复的。所以我们将 使用HQ作为毒物，来研究PARPl的DNA修复功能。 研究目的 interfere RNA)真核表达 本研究通过构建以RPJ基因的发卡样siRNA(small 细胞毒作用以及DNA甲基化过程中的作用，为进一步研究PARPl的功能奠定基 础。 1、材料与方法 1．1材料 1．1．1细胞 人支气管上皮细胞(HBE)由广州医学院馈赠，细胞以DMEM／10％FCS， 37℃，5％C02培养，常规培养传代。 1．1．2菌株 大肠杆菌DH5Q菌株由本教研室保存。 1．1．3质粒载体 Vector购于美NClontech公司，全长6．4kb，是 RNAi。ReadypSIREN．Retro I和EcoR 一带有BamH I两酶切位点的线性载体；pEGFP—C1绿色荧光蛋白载体购 于美国Clontech公司，全长4．7kb。 1．1．4主要试剂 四季青生物制品公司)；胰蛋白酶(美国AMRESCO公司)。载体克隆试剂：T4 DL2000和DNAmarkerDL15000 和胰蛋白胨(OXOID公司)；DNAmarker