以血管平滑肌细为靶标的抗动脉粥样硬化功效成分筛选及其作用机制初探.pdf

摘要 摘 要 血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖、迁移是引起心血管疾病的关键因 素之一。抑制血管平滑肌细胞的增殖，维持血管功能正常，是进行血管疾病预 防的重要措施之一。本课题以本实验室获得的体外培养人脐动脉血管平滑肌细 胞，并以高浓度血清刺激细胞增殖建立其异常增殖模型，以传统医学中具有治 疗“血瘀”效果的多种天然产物的活性成分如女贞子的齐墩果酸、当归的阿魏酸、 决明子的1，8．二羟基葸醌及山药的薯蓣皂苷元和大豆苷元及其衍生物等为研究 对象，观察其活性成分对于血管平滑肌细胞增殖、迁移与粘附等细胞行为的影 响变化，并初步探索了其影响机制。 用组织植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养。 倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生长状态，确定其生长曲线，考马斯亮 蓝R250染色观察细胞形态。结果原代培养细胞经三到四周的贴壁生长后迁移出 植块并铺满瓶底，生长状态良好，在光镜下观察单个细胞呈长梭形，细胞束状 排列，呈现漩涡状生长，生长汇合呈典型的“峰．谷”样，具有典型的平滑肌细胞 特征。经传代培养至第5代，细胞生长特性未见异常改变。表明成功建立了人 脐动脉血管平滑肌细胞系。 以高浓度血清培养VSMC，刺激细胞增殖生长，建立了VSMC的增殖模型。 结果显示：高浓度血清培养VSMC引起单位面积内细胞族簇生长，细胞数量显 著增加，细胞达1．02x106个，而未增殖的对照组为6．7x105个；细胞核染色明显， 反差增强；细胞总蛋白含量由对照组的6．216 BrdU对细胞 Ixg升高至10．964lxgl DNA的掺入量由对照组的O．776 P,g，有明显的掺入增 P,g增加到增殖组的1．3691 加；高浓度血清培养细胞48h后观察到细胞开始进入对数期，增殖生长提前， 具有增殖特性；细胞Go／Gl期的细胞数减少，进入S期的细胞数则明显增多，增 殖指数达77．79％；增殖细胞的平面迁移能力明显提高，增殖细胞组的迁移数目 为未增殖组的11．428倍，迁移距离为未增殖组的4．140倍；增殖组的细胞与细胞 外基质蛋白粘附结合能力有所增加，与骨桥蛋白的粘附数目是未增殖组的2．042 倍，与层粘连蛋白的粘附数目是未增殖组的1．742倍。因此，高浓度血清培养细 摘要 胞影响细胞行为，引起VSMC的增殖、迁移与粘附，可用于体外增殖模型的研 究。 研究了各功效成分对红细胞溶血、血清氧化、组织脂质过氧化及·OH、·02’ 和DPPH自由基的清除和对Fe”的还原能力。功效成分根据其分子结构的不同， 其抗氧化效果侧重不同。当归的主要功效成分阿魏酸主要通过清除自由基及还 原Fe”表现其抗氧化能力。对·02。和DPPH自由基清除的IC50分别为l19．33及 4．57 C的2．118倍。女贞的功效成分齐墩 pg／mL；对Fe3+的相对还原能力是Ⅵt C的2倍。山药功效成分1，8．二羟基蒽醌抑制血 I．tg／mL，对Fe”还原能力是Ⅵt 清自氧化、清除·02。、·OH自由基，其IC50分别为359．32、65．91和48．57 I上g／mL。 决明子功效成分薯蓣皂苷元抑制红细胞溶血和血清自氧化，其IC50分别为 197．50 l上g／mL和95．37 l上g／mL和1．84gg／mL。表明各功效成分可能通过对自由基清除、金属离子还原、 蛋白结合等方式抑制脂质过氧化、红细胞溶血，降低血清自氧化，从而对血液 氧化应激产生保护作用。 从细胞形态、蛋白和DNA合成、细胞周期等方面研究了天然产物功效成分 对VSMC增殖活性的抑制作用。功效成分影响细胞形态，延缓细胞生长，但均 不具有明显细胞毒性。在终浓度为100lamol／L时，阿魏酸、齐墩果酸、1，8．二羟 1．2．75 71．36和59．85％，结果表明各功效成分对血清诱导的平滑肌细胞增殖有