大鼠肝再生增强子基因克隆和基因表达的实验研究.pdfVIP

大鼠肝再生增强因子(ALR)基因克隆和 基因表达的实验研究 摘要 弘’：大鼠肝再生增强因子(ALR)是新近发现的一种促肝细胞生 长因子，菌其特殊萌墓茵结构特点及多种生物学作用，自发现以 来倍受重视。重组大鼠ALR可刺激l／3肝部分切除术(PH)后 肝细胞DNA合成，并可显著提高CCl。诱导的急性肝衰竭大鼠的 存活率。ALR是一种特殊的促肝细胞分裂原，在肝损伤修复过 程中发挥重要作用。本研究欲利用基因工程技术获得ALR的基 因克隆，并通过半定量逆转录．多聚酶链反应(RT-PCR)研究ALR 基因在急性肝损伤中的表达变化，以期为制备高质量的ALR基 因工程产品及从分子水平研究ALR的多种生物学作用提供实验 依据。 ， ／(一)大鼠肝再生增强因子的基因克隆 j本研究用异硫氰酸胍一步法，、从二周龄SD大鼠肝组织中提 取总RNA，在鉴定其纯度和完整性后，以总RNA为模板用偶联 一步RT．PCR法，制各ALReDNA编码区基因。为保证扩增片 段的特异性，本实验根据ALRcDNA序列，分别设计了P1、P2 和P3三条引物，P1、P2引物扩增片段长约400bp(包括完整的 编码区序列)，P3、P2扩增片段长约180 bp(编码区3’末端部分 序列)。经PCR法及Xho I酶切鉴定目的片段的特异性后，与温 度诱导型表达载体pBV220行体外定向重组，连接产物转化感受 态大肠杆菌JMl09。本实验通过菌落直接PCR法和限制性酶切 图谱分析筛选鉴定阳性克隆，并抽提重组质粒进行DNA序列测 定，结果与文献报道完全一致。重组菌JMl09／pBV．ALR进行42 ℃热诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)分析表明有 特异性重组蛋白条带出现，分子量约为15KD，与预期值相符。 (二)大鼠肝再生增强因子在CCI。诱导的急性肝损伤中的表 达变化 mRNA的表 为研究CCI。诱导的急性肝损伤大鼠肝组织ALR 达水平，本实验用半定量RT．PCR法检测了CCl4染毒0、6、12、 24h时ALRmRNA的表达量的变化。首先通过一次性腹腔注射 伤模型。分别在染毒0、6、12、24h时杀死大鼠，于肝固定部位 取肝组织，抽提各组肝组织总RNA。在ALR特异性引物Pl、P2 引导下，对提取的总RNA进行RT．PCR扩增，并以B一肌动蛋白 (13．actin)为内参对照。扩增产物经1．8％琼脂糖凝胶电泳分离 预期值大小相符。用日本岛津CS．9300双波长色谱扫描仪定量 分析电泳谱带，以特异性扩增产物(ALR)谱带峰面积积分值与 13．actin峰面积积分值之比作为ALRmRNA的相对表达量。各 变量用均数±标准差 mRNA平 (x±sJ表示。对照组ALR ALR mRNA表达 均相对表达量为0．2430+0．0719，CCI。染毒6h (PO．01)。本实验结果显示，CCl。诱导的急性肝损伤可使肝组织 ALR mRNA表达增加，提示ALR基因表达增加可能是机体损伤 后启动的保护机制之一。 结论： 1．从二周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因， 并实现了原核高效表达。 2． 首次用RT—PCR法证实，CCl。诱导的急性肝损伤可导致 肝组织ALRmRNA表达增加。 on and of CloningExpression Study Experimental theRat ofLiver Gene