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微波辐射对雄性大鼠生殖系统的昼夜时间毒性及分子机制 中文摘要 中文摘要 目的：微波辐射(Microwave Radiation, MWR)是一种重要的环境电磁污染物 （EEPs ），因无线通讯技术的快速发展，特别是全世界手机用户的急剧增加而备受 关注。由于微波辐射可对雄性生殖系统产生不良的影响，明确其作用途径和损伤 机制已成为迫切任务。已知哺乳动物的生理功能和行为存在昼夜节律，机体在 24 小时中不同时相对毒物及微波辐射敏感性不同。本课题采用时间生物学和生殖内 分泌毒理学相结合的策略，在建立微波辐射动物模型的基础上，研究微波辐射对 雄性生殖系统和褪黑素 （Melatonin ，MEL ）分泌的昼夜时间毒性，以及褪黑素通 过 GATA-4/SF-1 信号通路抑制睾酮合成的作用机制，为微波辐射对生殖功能损害 的防治提供新的思路。 方法：(1) 微波辐射对雄性大鼠生殖系统的昼夜时间毒性。以褪黑素日节律筛 选具有昼夜(L:D, 12h:12h)节律的 SD 大鼠，分别在授时时间 （zeitgeber time ，ZT, 以 ZT0 为光照开始）ZT0, ZT4, ZT8, ZT12, ZT16 和 ZT20 进行微波辐射（1800 MHz， 2 205µw/cm ），每次 2h ，每天一次，连续 32 天。对应的假辐射组 （Sham ）同样处 理但不给予微波信号。辐射后 24h 内每隔4h 尾静脉采血一次，ELISA 法测定睾酮 含量；同时 Sham 和 MWR 各时点组在辐射结束时点采集睾丸和附睾组织。测定附 睾精子活动度；制作睾丸 HE 病理切片，测定睾丸每日精子生成量、睾丸标志酶 ACP 和 γ-GT 活性，Real-time PCR 检测睾酮合成基因 StAR 和p450cc mRNA 表达。 利用余弦节律分析软件，根据方程式 F(t)=M+Acos(ωt+ Φ) 将各指标数据拟合为余 弦曲线，分析节律参数。(2) 微波辐射改变大鼠褪黑素分泌的昼夜节律。微波辐射 方法同上，辐射 32 天后，24h 内每隔4h 尾静脉采血一次，ELISA 法检测血浆褪黑 素浓度，同时 Sham 和 MWR 各时点组在辐射结束时点采集松果体，Real-time PCR 测定褪黑素合成酶 NAT mRNA 的表达。节律分析同上。(3) 褪黑素抑制睾酮分泌 的信号通路及微波辐射对睾丸间质细胞睾酮分泌的影响。以小鼠睾丸间质细胞系 -6 -8 10 -12 （TM3 ）细胞作为研究对象，添加不同浓度 (0, 10 , 10 , 10- 和 10 mol/L) 的 褪黑素，或先添加褪黑素受体阻断剂 （Luzindole ，1 µmol/L ）再加褪黑素，MTT 法检测细胞增殖、流式细胞仪检测线粒体膜电位、ELISA 法检测睾酮和 cAMP， Real-time PCR 和 Western blotting 测定褪黑素受体和睾酮相关基因 GATA-4，SF-1， I 中文摘要 微波辐射对雄性大鼠生殖系统的昼夜时间毒性及分子机制 StAR ，P450cc 和 3β-HSD 的mRNA 和蛋白的表达。通过睾丸注射褪黑素，利用免 疫组化和免疫荧光方法以整体动物实验验证褪黑素抑制睾酮合成的信号通路。采 2 用 TM3 细胞进行体外培养，在 1800 MHz 微波辐射 （205 µw/cm ）2h 后，流式细 胞仪检测线粒体膜电位，ELISA 法测定睾酮和 cAMP 含量，Real-time PCR 测定睾 酮代谢调节因子相关基因 SF-1、StAR 和 P450cc mRNA 表达的改变。 结果：(1) 微波辐射可使雄性大鼠睾丸组织发生病理改变