抗嗜肺军团菌血8型单抗的制备及军团菌环境分离珠的脂肪酸和16SrRNA基因部分序列分析.pdf

摘要 抗嗜肺军团菌血清8型单抗的制备及军团菌环境分离株的脂 肪酸和16SrRNA基因部分序列分析 摘要 背景：嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)于1977年被确认为军团病的病原体， 这一发现让军团菌科中唯一的军团菌属得以建立。在随后的研究中发现，2—5％的社 区获得性肺炎由军团菌引起。目前己发现的军团菌已有52个种，3个亚种，70多个 血清型。嗜肺军团菌有15个血清型，其中在中国6型最常见，其次为l型和8型。 军团病通常表现为严重的肺炎，但并不容易诊断，除了临床上重视不足外，军团菌对 培养条件的苛刻要求和较难鉴定也是重要原因。军团病无特殊临床症状，从临床症状 上无法与其它肺炎相区别，x线检查也与其它肺炎区别不大，诊断的关键在于对疑似 病例采用合适的微生物学检查方法，进行检测、鉴定和分型。 第一部分：抗嗜肺军团茵血清8型单抗的制备 方法： 甲醛灭活)免疫，首次免疫用福氏完全佐剂，第二次用福氏不完全佐剂，以后用生理 盐水稀释，免疫3到4次，融合前三天进行冲击免疫，取小鼠脾细胞与瘤细胞SP2／0 细胞融合；细胞培养上清用ELISA方法筛选出阳性的杂交瘤细胞，通过有限稀释法 进行3—4次克隆，获得能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株；杂交瘤细胞株采用Sigma 公司单抗分型试剂对单克隆抗体Ig类型进行鉴定。选择合适的Ig类型细胞株，利用 小鼠体内生产单抗的方法大量制备单抗，小鼠腹水收集后采用正辛酸一硫酸铵法进行 单抗纯化，紫外法测浓度，间接ELISA测效价。挑选合适单克隆抗体，建立双抗夹 心酶联免疫吸附试验检测方法。将其他血清型嗜肺军团菌14株，非嗜肺军团菌17 CFU／ml超声后，用上述双抗夹心酶联免疫吸 株及非军团菌1l株，分别稀释至至106 附试验方法进行检测，测定单克隆抗体的特异性；同时将嗜肺军团菌血清8型茵悬液 进行10倍梯度稀释，评价双抗夹心酶联免疫吸附试验的敏感性。 结果：经过4次克隆共获得8株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3C10， 和蛋白酶K试验表明，6G10和6C7针对的可能是菌体的脂多糖抗原。选取6G10与 6G10为捕获抗体，HRP标记的6C7为二抗，采用棋盘格滴定法确定包被抗体浓度为 2}tg／ml，二抗稀释度为1：4000，建立了双抗夹心酶联免疫吸附试验检测方法，用于检 CFU／ml，除金黄色葡萄球菌 测8型嗜肺军团菌。该方法的最低检出浓度为2．6x105 摘要 在106CFU／ml时有弱阳性反应外，其它血清型嗜肺军团菌14株，非嗜肺军团菌17 株及非军团菌11株，ELISA检测结果均为阴性，无交叉反应，具有较高的特异性。 结论：制备了具有较高特异性和一定亲和力的抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体，并 建立了双抗夹心酶联免疫吸附试验直接检测菌体的方法。 第二部分：军团菌的脂肪酸和16SrI矾A基因部分序列分析 方法：对156株分离自广州和新会各种环境的可疑军团菌菌株进行脂肪酸分析和 16SrRNA部分序列测定。所有菌株经过72小时培养，将菌体从BCYE平板上刮下， Sherlock(MIDI 按MIDI Inc，USA)标准操作程序进行皂化、甲酯化和萃取，甲酯化 脂肪酸的气相色谱分析由惠普6890气相色谱仪完成，按SherlockMIS操作手册所述 进行，分析条件由Sherlock软件控制。批内重复性由MIDI自带质控标准品控制，每 隔11个样品测定一次标准品；批间重复性通过每次测定时的质控菌株L 3 jamestowniensis(ATCC arithmetic UPGMA(unweightedpak-group average)方法，参数选择欧几里得距离 (Euclidian distance)，绘制树状图，进行菌株的鉴定和分群。同时，利用PCR扩增 16S rRNA 株16SrRNA基因序列数据