幽门螺杆菌超氧物歧化酶基因克隆、表达及多克隆抗体制备.pdfVIP

郑 州 大学 2加9 届硕 士研 究生 论文 幽门螺杆菌 sod 基因克陇 表达及多克隆抗体制备 幽 门螺杆 菌超 氧 化物 歧化 酶基 因克 隆 、表达及 多克 隆抗 体制 备 硕 士研 究生 张建光 导 师 段广才 郑州 大 学 公共 卫 生 学 院流 行病 学教研 室 郑 州 450051 摘 要 近 几年 的研 究揭 示 ，细胞毒 素相 关基 因 A 蛋 白 (Cytotox in 一assoe iated gene A ，CagA ) 是 幽 门螺杆 菌 (H .py lor i) 重要 的毒 力 因子之 一 。进 一步研 究 CagA 蛋 白的生物 学功 能及 其 参 与 H .py lor i 致病 的机 制 ，郑州 大 学 公共 卫 生 学 院幽 门螺 杆 菌研 究组利用 同源 重组技术 ，构建 了 CagA 基 因敲 除突变株 (Hp27 △ca gA) ，通 过 比较 遗 传 背 景 相 同的野 生株 与 突变 株 生物 学特 性 差 异 以及 利 用 蛋 白质 组 学 方 法对 其 菌体 蛋 白表 达 差异 的分析 ，筛选 和 鉴 定 出与 ca妞 基 因相 关 的 H .pylor i 功 能蛋 白。其 中超 氧化物 歧化 酶 (S 0D ) 为突变株 与野 生株 菌体表达 差异 蛋 白之 一 而 SOD 蛋 白与 CagA 之 间 的关 系 尚未 见报道 。为 了进 一步研 究 SOD 蛋 白与 Ca 动 之 间 的关 系 ，首先 我 们 需要 制 备 出 SOD 蛋 白的多克 隆抗 体 ，以便进 一步确 证 500 蛋 白在野 生株和 敲 除株之 间有 差异 。 方 法 (1) 自行 设计 引物 ，利用 PC R 技术扩 增 目的基 因片段 。 (2) 利用 Taq 聚合酶克 隆 的特 性 ，将扩增 的 目的基 因片段连接 到 成D19汀 载 体 上 ，并转化 大肠 杆 菌 (DH 5a )。 (3 ) 使用 Nde l 、Xh 。I 酶双 切 ，将 目的基 因片段 与 pET30 (a ) 连接 ，并 转 化 大肠 杆 菌 (BLZ I)。 (4) 诱 导表 达 后 ，利 用 融合 蛋 白带有 6 个 Hi s 标 签 的特 性 ，使用 N i一NTA 柱 纯 化 目的蛋 白。 (5) 将 纯化 出来 的 目的蛋 白作 为抗 原 ，免疫 兔 子 制 备 多克 隆抗 体 血 清 。 (6) ELISA 法 检 测 血 清 抗 体 效 价 。 结 果 (1) 以 Hp27 总 DNA 组 为模 板 ，扩 增 出 了 sod 基 因片段 。 (2 ) 将 PCR 扩 增产 物 纯 化 回收后 ，与 pMD 19一T 载 体 连 接 、转 化 DH5a 大肠 杆 菌 ，测序 后表 明成 功 构 建 了重 组质 粒 pMD 19一sod 。 (3) 测 序 后 表 明成 功 构 建 了重 组 质 粒 pET 30一sod 。 郑 州 大学 2 (X冷 届硕 士研 究生论 文 幽 门螺杆菌 耐 基 因克隆一表达及 多克隆抗体制备 (4) 1盯G 诱 导表达 后 ，蛋 白产物进 行 Ni一NTA 亲和层 析纯化 ，分离纯化 到 纯度 较 高 的其 C二端含有 6 个 组氨 酸标签 的 SOD 蛋 白。 (5) ELISA 检 测 血清抗体 效价 1 :3200 ，表 明成功制备 出多克 隆血清抗体 。 结论 (l) 首 次 由 饰 27 中克 隆 出 sod 基 因片段 。 (2) 对 重 组质粒 pET 3O一sod 进 行 诱 导表达 。研 究 了诱 导 时 间、诱 导剂浓度 、 等 因素对 之 表达 效 率 的影 响 ，确 定 了适 宜 的诱 导表达 条件 为 : I盯G 浓 度 0.1 nun o l/L ，诱 导 时 间 4.sh 。 (3 ) 可 溶