大鼠松果体生物基因的昼夜表达以及外周血淋巴细胞钟控基因的筛选与鉴定.pdf

大鼠松果体生物钟基因的昼夜表达以及外周血淋巴细胞钟控基因的筛选与鉴定 中文摘要 大鼠松果体生物钟基因的昼夜表达以及外周血 淋巴细胞钟控基因的筛选与鉴定 中文摘要 机体的生理功能、生化代谢、行为改变等均表现昼夜节律现象。这种节律的 紊乱可导致多种疾病，如飞行跨越不同地理时区的时差反应、昼夜轮班制作业引 起的睡眠障碍、激素分泌异常诱发的代谢失调与提前衰老、特殊节律缺陷导致的 神经精神疾病等。揭示昼夜节律的发生原因和调节机制，对解释正常机体的生理、 生化和行为现象以及因昼夜节律紊乱而引发的病理生理过程，乃至提出相应的防 治措施等都有重要的理论意义和应用价值。 nucleus， 调控昼夜节律的生物钟包括核心钟组织视交叉上核(Suprachiasmatic SCN)、松果体(Pineal gland，PG)和各种外周钟组织。其分子机制是在钟输入 信号的作用下，若干钟基因、钟相关基因和钟控基因及其蛋白产物通过转录一翻 译一翻译后事件的相互衔接，组成钟振荡器的自身调控反馈环路，实现钟信号的 精确输出。 至今，尽管人们对于昼夜节律生物钟振荡机制的认识有了长足的进步，但下 列问题还有待于澄清：首先，在哺乳动物中，作为核心生物钟昼夜分子振荡环路 中的重要钟基因—Cfoc忌，多以SCN为对象进行了相关研究，而在另一重要钟组 N．acetyltransferasegene，NAT,调控时间生物学信使—褪黑素分泌的关键基因)表 达的昼夜节律性、二者相关性及其光反应性还不清楚。其次，PG非依赖SCN的 钟振荡证据、Clock基因在SCN和PG中的昼夜转录差异及其光反应性比较，尚 不详尽。另外，钟控基因的概念提出时间不长，仍缺乏具体的实验依据。外周淋 巴细胞中是否存在着Clock的钟控基因，如果确定，其组织学分布和昼夜节律性 表达的时间轮廓(外观)是什么，也未见报道。本研究着眼于这些问题进行探讨。 目的： 建立昼夜节律的动物及淋巴细胞模型： (1)探讨大鼠PG与SCN钟基因 Clock和钟相关基因NAT的昼夜节律性表达及其光反应变化：(2)筛选与鉴定 人鼠松果体生物钟基肽l的昼夜表达以及外周m淋巴细胞钟控摹冈的筛选!j签定 中文摘要 外周血淋巴细胞Clock的钟控基因，确定其组织学分布。旨在进一步阐明中枢昼 夜节律的分子振荡基础和解析外周免疫钟运行的分子调控机制。 方法： (1)在12h光照、12 h-dark h黑暗交替光带lJ[12h-light：12cycle，LD(12：12)， 4周]和持续黑暗(Constant 大鼠造模，在一昼夜内每隔4h采集一组动物的PG和SCN组织(每组n=7)， 和NAT基因的mRNA表达水平变化，通过余弦函数和ClockLab软件获取节律 h：12 性参数，并经振幅F检验确定其昼夜节律性； (2)在LD(12h，4周)光 制下，对同一只大鼠分别在光照后2h和黑暗后2h于心脏采集外周血，分离淋 巴细胞，提取总RNA，运用差异展示RT—PCR、差异cDNA片段亚克隆及测序、 分析等技术，对外周血淋巴细胞昼夜表达差异性基因实施筛选： (3)分离、培 养外周血淋巴细胞，用RNA干涉和实时定量PCR技术，鉴定所获淋巴细胞蛋夜 差异cDNA片段是否为Clock下游的钟控基因；(4)在LD光制下，对所鉴定 的淋巴细胞钟控基因，用实时定量PCR检测其各时点昼夜节律性表达的时间变 化，并测定其在不同组织中的分布和表达丰度。 结果： 夜高昼低的节律性振荡(振幅F检验，P0．05)：(2)与DD光制下比较，LD (P0．05)，而各自的节律相位无明显改变； (3)在DD或LD光制下，PG中 time，CT) 检验，P0．05)，峰值均出现于主观夜