大黄酸、川芎嗪人参皂甙ReRg1对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用及相关机制的研究.pdfVIP

摘要 摘 要 血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化的早期表现，是一种弥散性病变，是人 类心血管疾病的主要危险因素之一。因此，本研究探讨了大黄酸、川芎嗪、人 umbilicalvein 参皂甙Re／Rgl对氧胁迫状态下人脐静脉内皮细胞(human endothelial cells，HUVEC)的保护作用，旨在筛选干预血管内皮功能障碍的功效 成分，从多路径探讨其作用的分子生物学机理，为预防和治疗血管内皮功能障 碍提供理论依据。 本研究采用H202诱导建立内皮细胞氧化损伤模型。将细胞分为对照组、H202 acid 损伤组和2,-．5个药物组。测定各实验组内皮细胞乳酸脱氢酶(1actic oxidedlsmutase，SOD)、 dehydrogenase，LDH)释放率、超氧化物歧化酶(super oxide 一氧化氮合酶(nilxogen 的变化趋势；通过MTT、激光共聚焦、流式细胞术评估正常和氧化损伤HUVEC 的存活率、细胞形态、凋亡、膜电位等指标；利用qRT-PCR和双向电泳分析各 胞内的吸收和代谢，建立HPLC测定药物分子在细胞内的吸收和代谢的快速测 定方法。应用蛋白质组学技术，从整体水平分析所用药物对细胞氧化损伤保护 作用的分子机制。其具体结果如下： 1．采用H202诱导成功地建立了血管内皮细胞氧化损伤模型，激光共聚焦显 微镜观察的结果表明，细胞形态发生了明显改变，产生了凋亡小体，说明H202 可能是通过促进细胞凋亡而使细胞受到损伤。 2．当大黄酸和川芎嗪浓度分别达到32 lxrnol／L和160lamol／L时，会抑制 HUVEC的存活，细胞的形态发生明显改变，呈现细胞毒性；人参皂甙Rgl／Re 达到250 I-tmol／L时，未见明显的细胞毒性。 3．应用HPLC测定细胞培养液所含大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re／Rgl的浓 度，发现随着孵育时间的延长，上述物质的浓度均有不同程度的下降。说明这 些物质能够进入细胞从而行使其保护细胞免受损伤的功能。 4．大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re／Rgl均能逆转或者消减H202对血管内皮 摘要 细胞产生的损伤，能使血管内皮细胞损伤的指标一LDH释放率降低，细胞的SOD 和GSH．Px活性升高，细胞的清除自由基的能力上升，细胞的脂质代谢产物MDA 的含量减少。说明上述物质可能是通过抗氧化机制保护了细胞免受氧化损伤； nitricoxide 5．H202诱导了NO分泌量、内皮型一氧化氮合酶(endothelial mRNA表达水平下降(西O．05)，而大黄酸、川芎 synthase，eNOS)活性和eNOS mRNA表达水平 嗪、人参皂甙Re／Rgl能减弱H202诱导的eNOS活性和eNOS 的下降。表明上述物质可提高eNOS活性进而增加NO的分泌量，从而保护细胞 免受氧化损伤。这可能是大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re／Rgl保护内皮细胞损伤 的另一个作用机制； 6．通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜，测定了细胞膜电位、细胞凋亡数 量、实时观察了细胞内Ca2+的变化，发现H202能够诱导内皮细胞凋亡。而大黄 酸、川芎嗪、人参皂甙Re／Rgl能够减少H202诱导的凋亡细胞数，恢复细胞膜 mRNA的表达，说明他们能够通过与线粒体诱导途径相关的CaspaSe依赖的抗凋 亡机制保护内皮细胞免受氧化损伤。 7．蛋白质组学的研究结果表明，H202诱导了7个蛋白点的表达水平发生了 上调，这些蛋白可能是通过氧化、促凋亡、影响能量代谢、脂肪代谢和DNA合 成等方式导致了细胞损伤。人