詹氏甲烷球菌NifH1与酿酒酵母Ndl1的克隆、表达、纯化及其初步晶体学研究.pdf

摘要 摘要 1 固氮作用是由固氮菌中的固氮复合物完成的。固氮复合物由固氮酶和固氮还 原酶组成，其中固氮酶是一个由NifD和NifK蛋白组成的α β异四聚体，固氮还原 2 2 酶是一个由NifH蛋白组成的同二聚体。目前，已经在没有固氮作用的嗜热产烷生 物詹氏甲烷球菌（Methanocaldococcus jannaschii ）中发现了固氮酶NifD/K和NifH 同源物的表达（命名为NflD/K和NlfH ，Nfl=Nif-like ，M. jannaschii 中的NlfH在这 里被称作Mj .NifH1 ），但是其功能还不清楚。解出Mj .NifH1的晶体结构将对我们 理解其功能以及了解其在进化上的作用提供很大的帮助。 在本课题中，我们构建了Mj .NifH1的表达载体，并通过镍柱亲和和HiLoad 16/60 Superdex 200 size-exclusion column凝胶层析等方法得到了纯化后的目的蛋 白。目的蛋白通过悬滴气相扩散法在287K进行晶体生长，并得到可以进行X射线 衍射和数据收集的蛋白晶体。在上海同步辐射加速器收集到一套最高分辨率为 3.3 Å的衍射数据。晶体的空间群是P4 32，晶胞参数为a = b = c =139.45 Å ，确定 1 每个不对称单位含有一个蛋白分子。 关键词：固氮酶，NifH ，詹氏甲烷球菌 2 动力蛋白(Dynein ）是一种细胞中的马达蛋白，可以将包含ATP 在内的化学 能转换为运动过程中的机械能，在有丝分裂、膜转运和胞内运输中起着关键作用。 动力蛋白作用的发挥需要许多蛋白的共同协调作用，如 NUDEL 家族中的一员 Ndl1 ，对于动力蛋白正常地定位到动粒上非常关键。Ndl1 可以激活动力蛋白调 节的蛋白转运，而当它结合到分裂激素和动力蛋白时，可以稳定动力蛋白或动力 蛋白激活蛋白，使其不会进行微管依赖的脱落过程，从而进一步产生分子马达的 作用。Ndl1 缺失时会导致结合到微管正极的动力蛋白减少，从而影响有丝分裂 等过程。 在本课题中，为获得酿酒酵母中 Ndl1 蛋白(Sc.Ndl1) 的晶体结构，为进一步 了解其发挥功能的分子机制提供线索，我们构建了 Sc.Ndl1 的表达载体，并表达、 纯化得到目的蛋白，并进行晶体生长。目前得到一颗 Sc.Ndl1 蛋白晶体，晶体优 化正在进行中。 关键词：有丝分裂，动力蛋白，Ndl1 ，酿酒酵母 Abstract ABSTRACT 1 Cloning, expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of NifH1 from Methanocaldococcus jannaschii Nitrogen fixation is catalyzed by nitrogenase complex in Azotobacter , which is composed by dinitrogenase and dinitrogenase reductase. Dinitrogenase is an α β 2 2 heterotetramer of the proteins NifD and NifK. Dinitrogenase reductase is a homodimer of the protein