pGEX-6p-1-Ag85A载体构建表达与口服减毒伤寒杆菌携带Ag85A+DNA疫苗免疫效应研究.pdf

·中文论著摘要· 1 pGEX…6pA985A载体的构建表达与口服减毒伤寒杆 DNA疫苗免疫效应的研究 菌携带A985A 刖 吾 目前全球约三分之一人口受到结核杆菌感染，每年死亡人数约300万人，卡 介苗(BCG)作为目前唯一临床使用的疫苗，其预防效果并不稳定【31，研制新型的有 效疫苗防治结核病成为当务之急。 迄今为止对于结核杆菌的保护性抗原仍不十分明确，细胞外分泌性或细胞壁 相关的蛋白被推测是保护性免疫应答识别的重要抗原。分泌型A985A被认为可作 为结核病DNA疫苗的候选目的抗原【91。比利时布鲁塞尔巴斯德研究所Huygen研 究组多年来在对A985进行的研究中发现，携带A985基因的质粒DNA疫苗经肌 经基因枪注射则主要产生Th2型免疫应答和抗体产生水平增加。而口服减毒沙门 氏菌携带A985DNA疫苗对小鼠免疫效应的影响目前尚无报道。通过基因工程制 备的减毒沙门氏菌以其有效地递呈抗原、发挥免疫佐剂作用以及激发黏膜免疫等 优势而被广泛用于DNA疫苗新型细菌载体的研究。减毒沙门氏菌经口服途径免 疫小鼠，不仅安全、高效，而且可激发产生黏膜反应，对同源病原体和异源病原 体均表现出良好的保护力【ll】。 1 本实验构建了pGEX…6p 特异性抗体及用于单克隆抗体的制备。并用减毒沙门氏菌携带A985A真核表达载 体经口服途径免疫小鼠，检测其免疫效应，为结核病DNA口服疫苗的临床应用进 ～步提供理论和实验依据。 实验材料 一、主要仪器 流式细胞仪，二氧化碳孵箱，倒置显微镜，酶标仪，离心机，低温冰箱，超 速离心机，超滤器，超净工作台等。 二、主要试剂 RPMI Plasmid DNAGelExtraction DNA MiniprepKit，Axyprep Kit，EasyTaq Polymerase， PuredNTPs，T4 I、 High EcoR II限制性内切酶， ELISA试剂 I、Bgl SDS．PAGE电泳相关试剂，IFN一丫、IL一4 盒。 三、实验动物 C57BL／6小鼠，6．8周龄，SPF级，购自中科院上海实验动物中心。 实验方法 一、pGEX-6p一1一A985A载体的构建与表达 1、质粒的提取与鉴定 Plasmid 1137。C水浴消化质粒，，酶切结 MiniprepKit提取质粒，用限制性内切酶Bgl 果经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 2、A985A编码基因的扩增 以V1Jns．tPA—A985A为模板，PCR扩增目的基因A985A。 3、重组质粒pGEX一6p一1一A985A的构建 用限制性内切酶BamHI幂IIEcoR I酶切A985APCR产物和pGEX．6p-1载体， 用T4DNA连接酶进行连接。 4、转化及重组质粒鉴定 Plasmid Kit 将重组质粒转化大肠杆菌(E．coli)BL21，用AxyprepMiniprep 提取质粒，BamHI和EcoRI酶切鉴定并测序。 5、蛋白表达检测 IPTG诱导蛋白表达，SDS—PAGE凝胶电泳和Western Blotting检测蛋白表达情 况。 2 DNA疫苗免疫效应的研究