疏肝健脾法对肝细胞诱导分化及调控机理的研究.pdfVIP

摘 要 目的：研究疏肝健脾法对肝干细胞增殖，诱导分化作用、促进肝再生及调控 机制，探索疏肝健脾法治疗慢性肝病的作用原理，为进一步研究治则治法提供新 思路。 方法：1．疏肝健脾法对肝干细胞增殖的影响：取对数生长期细胞用胰酶消化， 接种于96孔细胞培养板，细胞贴壁后同步化24小时，分为正常对照组，空白对 照组，疏肝健脾药物血清5％组、10％组、20％组，疏肝药物血清5％组、10％组、20％ 组，健脾药物血清5％组、10％组、20％组，作用24小时后采用四甲基偶氮唑蓝比色 D和CTGF受体表达分子机制研究：分为正常对照组、空白对照组、疏肝健脾组、 疏肝组和健脾组，1O％药物血清浓度作用细胞24小时后，裂解细胞，提取细胞的 总蛋白，蛋白印迹法(Western 受体蛋白表达情况。3．疏肝健脾法对肝干细胞体外诱导、分化作用研究：取5× 1 并加入10％疏肝健脾药物血清，同时设单纯培养体系对照孔。连续培养，于0、7、 肝干细胞向肝细胞分化的效应。4．疏肝健脾法对肝干细胞抗凋亡作用研究：调 正常对照组、空白对照组、疏肝健脾组、疏肝组和健脾组进行试验。作用24h后， 分别用Annexin 凋亡的药物拮抗作用。 5．疏肝健脾法对大鼠肝干细胞增殖及肝脏再生的机制研 究：分为正常对照组、模型组、疏肝健脾组、疏肝组和健脾组，运用2-AAF加三 分之二肝切除(2／3PH)法制作大鼠肝干细胞增殖模型；免疫组化法观察各组CK、 PCNA、波形蛋白、AFP、ALB的表达，进行模型评价；免疫组化法观察各组HGF、 EGF、FGF、TGF-D和CTGF受体表达，研究疏肝健脾法的作用机制。 结果：1．疏肝健脾法对肝干细胞增殖的影响：含药血清刺激组与空白对照组 含药血清干预组与血清干预组相比OD值均升高，且均有显著性差异(Po．05)，提 示高、中、低浓度的含药血清均能刺激WB-F344细胞的增殖；且以高浓度的含药 血清刺激增殖的作用最强，呈一定的量效关系；各浓度的含药血清均未表现出对 体的表达量最高，疏肝法组次之，健脾法组最少；疏肝健脾法组、疏肝法组和健 脾法组的肝干细胞WB-F344FGF受体表达量无显著性差异；疏肝健脾法组的肝干细 D受体表达量无显著性差异。3．疏肝健脾法干预组肝干细胞表面标志物AFPmRNA 在分化过程中逐渐减少，疏肝法和健脾法无疏肝健脾法干预组显著；疏肝健脾法 干预组肝干细胞表面标志物ALBmRNA在分化过程中逐渐增多，疏肝法和健脾法无 疏肝健脾法干预组显著。4．疏肝健脾法抑制凋亡作用最显著。5．有效建立了大 表达，且显著优于疏肝法和健脾法。 结论：1．疏肝健脾法(四逆散合四君子汤)、疏肝法(四逆散)、健脾法(四 君子汤)均对肝干细胞的增殖具有促进作用，且成一定的量效关系，对肝干细胞 R、FGFR 未表现出毒性作用。2．疏肝健脾法可以使HGFR、EGFR、CTGFR、TGF—B R、FGFR的 的表达量上调，疏肝法和健脾法也可以使HGFR、EGFR、CTGFR、TGF—D 表达量上调但没有疏肝健脾法显著；3．疏肝健脾法可以通过细胞因子体系对肝干 细胞的增殖、分化进行调节，疏肝健脾法可以促进肝干细胞向肝细胞的分化。4．疏 肝健脾法具有抑制肝干细胞凋亡的作用，且作用优于疏肝法和健脾法。5．疏肝健 等细胞因子实现的． 关键词：疏肝健脾肝干细胞卵圆细胞诱导分化调控机理 Abstract ives：toinvesti tetheeffectsofthe method(the Object ga shuganjianpi and Method)onthe iferationand Liver—soothingSpleen—fortifying prol iat ion l iver ionand induceddifferentionof