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RNA-seq技术原理及应用 报告人：柳晓东 2012.4.16 1、RNA-seq技术简介 2、RNA-seq技术原理 3、RNA-seq技术优势 4、RNA-seq技术应用 5、RNA-seq发展前景 一、RNA-seq技术简介 转录组的含义： 转录组是指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和, 主要包括mRNA和非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。 转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，是解读基因组功能原件和揭示细胞及组织分子组成所必需的。 有关ncRNA的一些知识： 二、RNA-seq技术原理 高通量测序 高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 三种高通量测序简介： 自2005年以来,以 Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生。之后Helicos Biosciences公司又推出单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术。 三种高通量测序技术的优缺点 高通量测序中重要名词解释 1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深度为10×。 2、覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中高GC含量，重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装的序列往往无法覆盖所有的区域，这些区域就叫做Gap。 二者的关系：测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。当测序深度在10～15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保证。 3、RPKM（reads per kilobase per million reads）是每百万读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为: 其中，total exon reads指映射到某个基因上的reads数，mapped reads指map到所有基因的总的reads数。 RPKM不仅对测序深度作了归一化，而且对基因长度也作了归一化，使得不同长度的基因在不同测序深度下得到的基因表达水平估计值具有了可比性，是目前最常用的基因表达估计方法。 三、RNA-seq技术优势 相对于传统的sanger测序法，RNA-seq具有以下优势： 1、数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。 2、高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。 3、任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。 四、RNA-seq技术应用 1、转录本结构研究 利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。 2、转录本变异研究 在发现序列差异方面，如融合基因鉴定、编码序列多态性研究等，RNA-seq也具有很大的潜力。 3、非编码区域功能研究 转录组学研究的一个重要方面就是发现和分析ncRNA。 ncRNA按其功能可分为看家ncRNA和调节ncRNA。前者通常稳定表达,发挥着一系列对细胞存活至关重要的功能, 主要包括转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核 RNA(snRNA)及小核仁 RNA(snoRNA)等；后者主要包括长链 ncRNA(lncRNA)和以microRNA为代表的小ncRNA(small ncRNA), 在表观遗传、转录及转录后等多个层面调控基因表达。 4、基因表达水平研究 相比于传统的芯片技术，RNA-Seq技术能更准确地确定细胞中RNA的表达水平。原则上，RNA-Seq有可能确定细胞群中的每一个分子的绝对数量，并对实验之间的结果进行直接