第三节等电聚焦(IEF)生化分析精要.pptVIP

等电聚焦技术 根据建立pH梯度原理的不同，梯度又分为载体两性电解质pH梯度和固相pH梯度。前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度，后者是将缓冲基团成为凝胶的一部分。 pH梯度形成的过程 1. 没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子 都带电荷，只是溶液中正电荷和 负电荷的基团数目相等，净电荷 为零。 2. 引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带 有最低等电点的分子（带最多的负电荷）将最快 的向阳极迁移，当它达到净电荷是零的位置时才 停止。 其次是一些低pI的载体两性电解质分子 （带有其次多的负电荷）也将向阳极移动， 直到它的净电荷被减少到零即停止。 3. 电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的办 法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置，而 形成一个pI梯度。 提高疏水蛋白在水中的溶解性 1. 尿素 改善疏水蛋白接近pI时的可溶性，也可增加 多肽的溶解度。 2. 非离子去污剂和两性离子去污剂 能在不破坏蛋白质结构保持生物活性的情况 下改善蛋白的溶解度。 尿素和去污剂结合使用是提高疏水蛋白可溶性的最好方法。 等电聚焦的优缺点 优点： 分辨率高 很稀的样品都可分离，且重现性好 可用于蛋白质或多肽的分析分离，等电点测定，双向电泳第一向 缺点： 要求使用无盐溶液，而某些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，可能产生沉淀 样品中各组分都聚焦到其等电点，对一些在等电点不溶解或发生变性的蛋白质不适用。 固相pH梯度等电聚焦（Immobilized pH gradients isoelectric focusing，IPGIEF） IPGIEF是80年代建立起来的一种新型等电 聚焦技术。它利用一系列具有弱酸或弱碱的丙烯 酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯 度并参与丙烯酰胺的共价聚合，从而形成固定 的、不随环境电场等条件变化的pH梯度。 IPGIEF比传统等电聚焦有更高的分辨率 （可达0.001pH），更大的上样量，是目前分辨 率最高的电泳方法之一。 瑞典LKB公司的商品名为Immobiline；瑞士Fluka公司的商品名为pI Select，结构式是： 固定化电解质Immobiline的一端是双键，可以 在聚合过程中通过共价结合到聚丙烯酰胺介质中。 所以在电场中也是固相的。另一端的R基团为弱酸 或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体 系，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可行 成近似线性的pH梯度。 * 一、概述 等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)是60年代建立的一种高分辨率的蛋白质分离和分析技术。它是利用具有pH梯度的支持介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。 第三节 等电聚焦 (isoelectric focusing，IEF) 等电聚焦是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定地、连续的、线性pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 二、 蛋白质等电聚焦电泳的基本原理 蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，静电荷数为零，在电场中不再移动，就会产生聚焦现象，形成蛋白质区带，由此可以将不同等电点的蛋白质分开。 三、载体两性电解质 载体两性电解质的合成 1961年Svensson H提出的载体两性电解质的理论基础，1964年Vesterberg O利用多乙烯多胺和不饱和酸合成了载体两性电解质，它是由脂肪族多氨基多羧基的异构物和同系物组成，它们有连续改变的氨基与羧基比。 2. 作为理想的载体两性电解质，应该具备一些必要的性质: ①载体两性电解质应溶解性能好，在pI处缓冲能力强，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其他两性电解质改变pH梯度。 ②导电性能良好，具有相同的电导系数。 ③载体两性电解质应化学性质稳定，无毒、无生物学效应，不影响蛋白质活性。 ④载体两性电解质紫外吸收低，与蛋白质可逆结合，相对分子质量小，易从聚焦的蛋白条带中除去，有利于蛋白质的检测和分析。 四、pH梯度的形成 载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物，通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度，凝胶的防对流扩散作用使pH梯度保持稳定。 五、电泳条件的选择 1. 电泳方式 2. 支持介质的选择 在等电聚焦中大多使用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶化学稳定性好，透明度高，分辨率高，电渗小，不影响pH梯度的形成和蛋白质