小鼠胚胎干细胞hprt基因的定位致变.pdfVIP

遗传 HEREDITAS (Beijing)16(5):1-51994 ·研究报告 · 小鼠胚胎干细胞hprt基因的定位致变 刘爱民 尚克刚 北（京大学生物学系，北京 100871) 摘 要 利用DNA的同源重组原理，通过基因打靶技术，在小鼠胚胎干细胞(E（S细胞）中将pMCI-neo 导人hprt座位，实现了基因组内指定基因的定位致变．通过电穿孔导人质粒pRV4.0线性化DA，分别 用G418与6-TG筛选HPRT一突变子．经抗性检验及DNA印迹分析，证明得到了一株预期的定位转 化细胞，转化效率为1.32x10一 载体的非同源序列对定位致变的效率和整合方式没有影响，由于采取 了有效的措施，所获HPRT-ES细胞株仍维持了未分化和二倍体状态，保留了胚胎干细胞的特性． 关锐词 ES细胞系，基因打靶，hprt基因 TargetedDisruptionofhprtGeneinMurineEmbryonicStemCells LiuAimin ShangKegang (DepartmentofBiology,PekingUniversity,Beijing100871) Abstract hprilocushasbeendisruptedinmurineembryonicstem(ES)cellsbygenetargeting.The linearizedtargetingvectorpRV4.0wasintroducedintoEScellsbyelectroporation.HPRT-mutantsin whichthehprtgenehadbeendisruptedbyinsertionofpMCI-neocassetteintoits8thexonvia homologousrecombinationwasselectedwithG418and6-thioguanine.ThreeindependentEScellstrains wasisolatedinapoolof7.6x107treatedcells.WithfurthertestsofdrugresistanceandSouthern hybridizationitwasprovedthatonlyC19wastheHPRT-mutantinwhichtargeteventdidocurred.The overalltargetedefficiencywas1.32x10-.TheheterologoussequenceofpUC9DNAflankingthetar- getingsequencedidnotaffectthetargetedefficiencyandintegrationpatternofDNA.Asaresultofthe carefulchoiceofcultureconditionandtransformingprocedure,theHPRT-ESstrainC19stillremained itsundifferentiatingfeatureanddiploidkaryotype. Keywords EScellline,Genetargeting,hprtgene 次黄嗓吟鸟嗦吟磷酸核糖转移酶(HPRT或HGPRT,EC2.4.2.8)，是嚷吟合成旁路中十分重 要的一种酶．HPRT功能丧失的患者呈现Lesch-Nyhan综合征．由于hprt基因位于X染色体 上，而且该基因的突变可以通过HAT或6-TG等加以分离，因而引起人们很大的兴趣。 小鼠胚胎干细胞(E（S细胞）是一种可在体外培养的胚胎性多能干细胞，通过嵌合体途径可分 化为生殖细胞。因此，通过ES细胞的基因操作可得到按设计要求改造基因的动物 ’‘·2)． Hoope：等 ’〔）及Kuehn等 6〔）通过ES细胞的随机突变得到了HPRT-的小鼠。同时， Thomas和Capecchi”〔〕及Doetschman等 3〔〕利用同源重组定位致变了ES细胞的hprt基 因，获得HPRT一的ES细胞 ‘Z,heng等 1s〔)，Reid等 8〔),Hasty等 4)〔，Valancius等 12〔〕也利用 2 遗