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遗传 HEREDITAS(Beijing)19(3):44--481997 用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱 钟筱波 PaulF.Fransz J.HansdeJong PimZabel 荷（兰瓦赫宁根农业大学分子生物学系） HighResolutionPhysicalMappingbyFluorescence insituHybridization ZhongXiaobo PaulF.Fransz J.HansdeJongand PimZabel (DepartmentofMolecularBiology.WagemngenAgriculturalUniversity,TheNetherlands) DNA序列在染色体上的定位和分子图谱 (molecularmap）的构建是克隆目的基因的基础．用常规分子生物 学技术构建分子图请是基于对DNA分子标记 m（olecularmarker)，如RFLP,RAPD,ALFP等的遗传分析， 从中找出不同DNA序列之间的连锁遗传关系和相关位置．这种分析方法的准确性和图诺的分辨率 (resolution）水平将取决于染色体减数分裂时DNA的重组率 （meioticrecombination)。但由于重组率在染色体 上的分布是不均匀的，Sherman和 Stack(1995)发现靠近着丝点 （centromere）的异染色质 (heterochromatin）区的DNA重组率要比远离着丝点的同染色质 e（uchromatin）区低很多。这样就会造成两个 分子标记之间的遗传距离 （geneticdistance）由于在染色体上的位置不同而与真实的物理距离 （physical distance）发生偏差。因此，人们需要一些更准确的技术来弥补这种偏差。近年来，随着DNA荧光原位杂交技 术 F（luorescenceinsituhybridization，缩写为FISH）的不断发展，一种更直接的，在染色体甚至DNA纤维 (extendedDNAfibre)水平上直接构建分子图谱的新方法正不断走向成熟。 DNA荧光原位杂交技术是80年代末才开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理 是将DNA探针用特殊修饰的核昔酸分子标记 如（biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP)，然后将标记的探针直接 原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特性结合来检测DNA 序列在染色体或DNA纤维上的定位。FISH技术与其它原位杂交技术相比，除了具有不需要放射性同位素、实 验周期短、检测灵敏度高等优点外，还由于它可以用不同的修饰核昔酸分子标记不同的DNA探针，再用不同的 荧光素分子检测不同的探针分子。因此，可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位， 直接得到它们的相关位置和顺序。Ried等 （1992)用3种不同标记的核昔酸，以不同的比例混合标记，在人的 有丝分裂中期染色体 （mitoticmetaphasechromosome）上可以同时检测到7个DNA探针。Dauwerse等 (1992)已将FISH技术发展到可同时检测12种DNA探针分子。目前，FISH已成为一种最直接分析DNA序 列在染色体或DNA分子上排列的分子细胞遗传学技术。它已被广泛地应用于动植物基因组结构 g（enomeorgan- ization）的研究和DNA分子物理图谱 p（hysicalmap）的构建 （参见Joos等1994,Jiang等1994,Heiskanen 等 1996的综述）。 在用FISH技术构建DNA分子图谱时，它的分辨率 （resolution)是指两个不同DNA探针能够被检测到 的最小距离，也是最关键的技术指标。它将决定分子图谱的准确性和精密程度。在决定FISH分辨率的因素中， 最重要的是所使用的靶DNA在染色体或DNA纤维上的浓缩度 （condensation)，亦即DNA在染色体结构或 DNA纤维上的三维空间包裹程度。浓缩度越高，分辨率越低。FISH技术的发展过程也正是分辨率水平由低向 3期 钟筱波等：用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图诣 45 高不断进步的历程。本文将结合对FISH技术在不同染色体或DNA纤维切片上的分辨率水