分子生物学蛋白质组学的研究方法和进展解读.ppt

1 基因组计划的局限 无法解决“基因精细调控”问题 　——大规模基因表达检测技术如：微阵列法、DNA芯片及SAGE — “mRNA” 无法反映蛋白质的质与量。 　　　以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。 后基因组时代 　 功能基因组学成为研究重心 　 蛋白质组学是其“中流砥柱”，成为战略制高点 第一节 蛋白质组学的概念及其发展史 什么是蛋白质组？ 蛋白质组学(proteomics) 应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学。 从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 主要研究内容 什么是功能蛋白质组学？(functional proteomics) 功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。 介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。 The HUPO World… 一、蛋白质组表达模式研究方法 研究蛋白质组的组成成分 主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。 （一）蛋白质组研究中的样品制备 采用细胞或组织的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 进行样品预分级，将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究，可提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。 样品预分级的主要依据 蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等 组织水平蛋白质组样品制备 原因：临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤组织中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。 激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM) 可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。 （二）蛋白质组研究中的样品分离 关键技术：双向凝胶电泳 （two-dimensional electrophoresis，2-DE) 利用蛋白质等电点和分子量差异，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。 工作原理： 根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电聚焦电泳分离 转移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子量大小不同进行分离 固相pH梯度等电聚焦的优点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 可以随意精确设定pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。 双向电泳方法的主要步骤： 1. 样品准备 　2. 第一向：固相pH梯度等电聚焦 　3. 第二向：SDS电泳 　4. 染色： 考马氏亮兰或银染 　5. 图像分析：肉眼或自动扫描 固相pH梯度等电聚焦电泳（第一向）示意图 Differential Expression 2D Gel Databases Biobase 角质形成细胞,膀胱癌等 (丹麦Center for Genome Research) http://biobase.dk/cgi-bin/celis ECO2DBASE 大肠杆菌 (在NCBI库中) /respository/ECO2DBASE Heart-2DPAGE 人心肌 (德国柏林) http://www.chemie.fu-berlin.de/user/pleiss HSC-2DPAGE 人类心脏 (英国Harefield, Heart Science Center) http://www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.html LSB 人类,小鼠和大鼠肝脏等 (美国Large Scale Biology) .2dmaps/patterns.html QUESTRef52 细胞,大鼠胚胎,酵母 (美国Cold Spring Harbor Lab) / SWISS-2DPAGE 十个人类图谱,包括: 肝, 浆细胞, 红细胞, 血小板, 以及酵母, 大肠杆菌 (瑞士日内瓦, University Hospital)2-DE数据库http://expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.html Yeast S. cerevisiae, S. pombe等 (瑞典Goteborg University) http://yeast-2dpage.gmm.gu.se/ Yeast S. cerevisiae (美国Proteome Inc.) /YPDhome.html 2-DE技术的优