第十章植物种质的超低温保存精要.pptVIP

第十章 植物种质的超低温保存 种质保存的概念 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中所含有的遗传物质保持其完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。 种质保存的途径 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠害侵扰。 种植保存：占地多，管理费用高。 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的技术。应用前景广阔。 一、离体保存方法 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态，需要时可迅速恢复生长。 抑制生长的方式： 降低温度 降低环境中的氧含量 使用生长延缓剂 其它方法 离体种质保存的优点 占用空间少，节省人力 、物力和土地； 便于种质资源的交流利用； 需要时，可以利用离体培养方法很快大量繁殖； 避免自然灾害引起的种质丢失。 二、超低温冰冻保存技术 （一）原理 原理：液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止了，因而排除了遗传性状变异的可能性，达到长期保存植物种质的目的。 在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的稳定，是迄今唯一不需要继代的、可靠的长期保存方法。 （二）关键问题及解决措施 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生结冰。 解决措施： 选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成； （三）基本程序 1、材料的选择： 组织、细胞特征：细胞分裂旺盛、体积小、原生质浓厚的分生细胞或组织； 培养时期：旺盛的对数生长期（抗冻力和存活率高） 大小：适宜 （三）基本程序 2、材料的预处理 处理目的：减少细胞内自由水的含量，使细胞经受低温锻炼，以提高组织或细胞的抗冻能力。 处理方法： 低温锻炼 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO、蔗糖） （三）基本程序 冰冻保护剂0℃预处理 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细胞中清除。 常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、PEG等。 （三）基本程序 3、降温冰冻操作 1）直接快速冷冻 2）分级冰冻法 3）玻璃化法 4）干燥冷冻法 5）包埋冻存法 快冻法 0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。 降温速度：每分钟1000 ℃以上。 适用对象： 高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、块根等。 抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木本植物的枝条或芽。 分级冷冻法 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞等） 程序降温仪 起始温度 0.1-10℃的降温速度 -70℃~ -40℃ 液氮 两步冷冻法 转移温度 分级冰冻法 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃、-15 ℃、-23 ℃、-40 ℃等，一般每级约停留5min，然后学好入液氮。 玻璃化法 玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。 原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的改变。 玻璃化法 优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。 影响因素： 玻璃化冰冻保护液的组成及浓度； 植物材料的脱水温度和脱水时间。 4、化冻操作 快速化冻：适用于大多数材料 慢速化冻法：适用于含水量较低的材料 （5、去除冰冻保护剂） 6、化冻材料的活力检测： 根本方法：再培养 （三）基本程序 THE END 植物细胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90%，很容易冻结。理论上讲，细胞外水的冻结温度为零下5度到零下15度，细胞内游离水的冻结在零下25度，而结合水在零下100度也不会冻结。根据Luyet的冻结理论，细胞内游离水的冻结温度可以认为是细胞冻存的安全温度，一般将零下30度视为一些技术研究的基础温度。 * * * 植物细胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90%，很容易冻结。理论上讲，细胞外水的冻结温度为零下5度到零下15度，细胞内游离水的冻结在零下25度，而结合水在零下100度也不会冻结。根据Luyet的冻结理论，细胞内游离水的冻结温度可以认为是细胞冻存的安全温度，一般将零下30度视为一些技术研究的基础温度。 * * *