细胞生物学研究方法精要.ppt

要研究细胞的各中结构和成分的化学性质和生理功能，需要把它们分离和抽提出来进行研究。 离心是研究亚细胞成分和生物大分子的必要手段。 细胞匀浆后，悬液中含有各种细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等）及各种大分子。要想把它们一一分离开，只利用普通低速离心机是很难做到的。 五、超离心技术 第二节 生物化学分析技术 离心机结构与原理示意图 马达 冷冻 真空 沉降物 转子 装甲室 第二节 生物化学分析技术 离心机结构与原理示意图 马达 冷冻 真空 沉降物 转子 装甲室 第二节 生物化学分析技术 被离心的物质所受的离心力不仅与转速有关，而且还同物质到转头中心的距离有关。因此要准确表示离心条件要用离心力，而不单是转速。 离心力(g)是由角速度和旋转半径(R)的大小决定的，单位为克，计算公式如下: g = ω2·R (2?n)2 3600?980 ?R g = 第二节 生物化学分析技术 各种颗粒在离心场中的沉降速度不同，这取决颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬液介质的密度和粘度有关。 式中S为沉降系数(秒)；R为沉降颗粒到转头中心的距离(半径，cm)；ω为角速度，以每秒转动的弧度表示；t为时间(秒)。 当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离离心场强度的沉降速度为定值，此即为沉降系数(sedimentation coefficient, S)。 第二节 生物化学分析技术 根据分离的对象和目的不同，超离心技术可分为两大类： 用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品 分析和测定制剂中大分子的种类和性质(浮力密度和分子量等) 制备离心 (preparative cetrifugation) 分析离心 (analytical centrifugation) ? ? 第二节 生物化学分析技术 利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图 匀浆物 肝脏 上清夜 完整 细胞 完整 细胞 1000g 20min 核 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 微粒体 内质网 100000g 120min 105000g 20min DNase 静置20min 10000g 20min 核糖体 第二节 生物化学分析技术 差速离心 密度梯度离心 CsCl密度? 梯度离心 蔗糖密度? 梯度离心 第二节 生物化学分析技术 低速离心 中速离心 高速离心 超高速离心 细胞匀浆 细胞 核仁 细胞骨架 大细胞器 小细胞器 核糖体 大分子 离心 样品 蔗糖的稳定梯度 慢速沉降成分 快速沉降成分 分画 样品 蔗糖的不连续梯度 低浮力密度成分 高浮力密度成分 流式细胞分选术 (fluorescence-associated cell sorting, FACS) 激光 细胞悬液 鞘液 液滴加电信号 探测器 超声波振摇器 加负电的液滴 加正电的液滴 细胞收集容器 细胞收集容器 废液容器（未探测细胞） 第二节 生物化学分析技术 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。 六、分子杂交技术 原理：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。 这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 第二节 生物化学分析技术 (molecular hybridization) 核酸杂交原理示意图 第二节 生物化学分析技术 在高pH值下，染色体DNA解链，带标记的核酸探针即可与染色体一定部位的互补单链DNA杂交。 这种方法既可检测DNA序列，也可检测RNA序列。既可用放射性探针法，又可使用免疫探针法。 在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术，称为原位杂交(in situ hybridization)。 第二节 生物化学分析技术 荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH): FISH技术的原理图解 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 DNA chip技术 第二节 生物化学