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第2章 医学细胞生物学研究方法 熊静波 副教授 基础医学院细胞生物学教研室 教学内容 第一节 细胞生物学基本研究方法 显微镜技术、细胞化学技术、细胞分离和分析技术、细胞培养技术 第二节 细胞生物学其他研究方法 细胞工程技术、分子生物学技术 第一节 细胞生物学基本研究方法 显微镜技术 细胞化学技术 细胞分离和分析技术 细胞培养技术 一、显微镜技术 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统； ②光学放大系统； ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 （二）荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 （三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 Colocalization of BRCA1 and c-Myc in MCF-7 cells（Xiong J， et al. MCB. 2003, p. 8668–8690) （四）暗视野显微镜 dark field microscope 用于观察活细胞等无色透明标本 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 （五）相差显微镜 用于观察活细胞和未经染色的标本 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快 （六）电子显微镜 透射电子显微镜，transmission electron microscope, TEM 以电子束作光源，电磁场作透镜。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。 2. 扫描电子显微镜 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 3. 分析电子显微镜（自学） 二、细胞化学技术 概念：形态观察和组分分析相结合的分析方法，是在保持组织原有结构的情况下，利用细胞内组分的物理、化学特性来研究其在细胞内的数量、分布及动态变化。 （一）免疫细胞化学技术 （二）酶细胞化学技术 （三）原位杂交 （一）酶细胞化学技术（enzyme cytochemistry） 检测原理 酶+底物→产物 （二）免疫细胞化学技术（immunocytochemistry） 根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。 常用的标记物有荧光素、酶、胶体金、铁蛋白、生物素、亲和素。 免疫细胞化学反应的检测方法 直接法： 标记一抗体；快速；非特异性反应少 间接法：标记二抗； 灵敏度高； 检测方法 免疫荧光法（immunofluorescent technique）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。 酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。 PRA在散发性浸润性乳腺导管癌中的表达 （三）原位杂交技术 自学 三、 细胞分离技术 Stokes 公式 dX/dt=[2r2 (ρp—ρM) /9η]·g=s ·g 式中dX