第三章核酸核酸的理化性质.pptVIP

第三章 核酸 1、状态：DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末； 2、溶解性：微溶于水，不溶于一般有机溶剂（乙醇沉淀核酸），其钠盐易溶于水； 3、粘度：DNA的粘度极高，而RNA粘度要小得多； 3,5-磷酸二酯键断裂 切割点不同，产物不同，如3‘-单核苷酸，5’-单核苷酸 水解磷酸二酯键的酶：核酸酶 （2）酸水解 酸性条件下，磷酸二酯键比糖苷键稳定，嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键稳定性最差。 若对核酸进行酸水解，首先生成的是无嘌呤酸。因此对核酸进行部分水解时，很少采用酸水解。 根据底物不同：DNA水解酶（DNase） RNA水解酶（RNase） 根据作用方式：核酸外切酶 (限制性和非限制性) 核酸内切酶 (5′→3′或3′→5′) 核酸内切酶的作用方式是从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸 实验室常用的RNase有3种： 牛胰核糖核酸酶（RNase I）：专一性内切酶，产物为3′-嘧啶核苷酸及以3′-嘧啶核苷酸为结尾的寡核苷酸。 核糖核酸酶T1：产物为3′-嘌呤核苷酸及以3′-嘌呤核苷酸为结尾的寡核苷酸。 核糖核酸酶T2：主要作用于Ap残基，将tRNA降解为 3′-腺苷酸为末端的寡核苷酸。 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。 1、概念：指核酸的双螺旋区的氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规则线团状态的过程 2、变性因素：加热、酸碱度改变、有机溶剂、酰胺、尿素等。 3、DNA变性的实质：DNA双链间氢键的断裂，生物活性丧失。 （一）核酸的变性 4、特点：并不涉及共价键的断裂，即磷酸二酯键不发生断裂，因此一级结构不发生变化。 5、变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变。 （二）核酸的复性 2、复性表现：许多理化性质可恢复，生物活性得以部分恢复。 3、影响复性的因素：分子量越大复性越难；浓度越大，复性越容易；DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。 DNA复性 六、核酸序列测定——Sanger法 应用最广。 原理： 碱基配对； 聚合酶可催化在试管内合成与模板互补的 DNA新链； 双脱氧核苷酸无3’-OH，合成到此终止； 可电泳分离随机得到的大小不等的片段。 * * 核酸的性质及序列测定 第四节 一、核酸的一般理化性质 （一）物理性质 核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。 （二）稳定性 核酸可被酸、碱或酶水解成各种组分，即核酸的降解 （1）碱水解：RNA可在室温下被稀碱水解成核苷酸，而DNA对碱稳定。例如，在0.1mol/L NaOH溶液中，RNA几乎完全水解，随着磷酸二酯键的断裂，先生成2′,3′-环核苷酸中间物，最后生成2′-或3′-磷酸核苷的混合物；DNA由于不存在2′-OH，不能被碱水解。 利用上述性质可测定RNA的碱基组成或除去溶液中的RNA。 1、酸或碱水解 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度不同。 1、酸或碱水解 3、酶水解 核酸酶分类 5’ 5’ 3’ 3’ 外切位点 外切位点 内切位点 内切位点 3、酶水解 实验室常用的DNase有2种： 牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNase I）：水解产物为平均长度为4个核苷酸，以5′-P为末端的寡聚核苷酸。 牛胰脱氧核糖核酸酶II（DNase II）：水解产物为平均长度为6个核苷酸，以3′-P为末端的寡聚核苷酸。 3、酶水解 非特异性核酸酶：即水解DNA又水解RNA的酶。有些非特异性核酸酶也作为工具酶应用到科学研究中。如：蛇毒磷酸二酯酶和脾磷酸二酯酶均是水解DNA和RNA的外切核酸酶。前者从3′端开始，生成5′单核苷酸，后者从 5′末端开始，生成3′单核苷酸。 D-核糖与浓盐酸和苔黑酚（甲基间苯二酚）共热产生绿色； D-2-脱氧核糖与酸和二苯胺一同加热产生蓝紫色。 以此区别DNA和RNA，或作为定量测定基础。 二、核酸的紫外吸收 DNA或RNA的定量 A260 = 1.0 相当于 50μg/ml 双链DNA (dsDNA) 40μg/ml 单链DNA (ssDNA or RNA) 20μg/ml 寡核苷酸 确定