第二章电泳学基础.pptVIP

一、定义及原理 1、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。 以生物大分子为例阐明电荷来源 电泳淌度 电泳淌度 (Electrophoretic Mobility)是单位场强下离子的平均电泳速度。因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度而不用速度来描述荷电离子的电泳行为和特性。 当电泳达到稳态时，电动力等于介质的阻力，即F=F’。因此，我们得到 (2.89) 因此，将方程(2.78)和（2.79）的结合，我们得到 (2.90) 带电粒子的电泳淌度在一定条件下取决于粒子本身的性质，即与其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。 指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。 电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。 它具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小 (1～100μg）、分辨率高等优点。 毛细管电泳的基本工作原理：溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。 毛细管区带电泳是通过 在充满电解质溶液的毛细管中， 不同质荷比大小的组分在电场 的作用下，依迁移速度的不同 而进行分离的。根据组分的迁 移时间进行定性，根据电泳峰 的峰面积或峰高进行定量分析。 1. 高灵敏度 2. 高速度 3. 高分辨率 4. 样品少 5. 自动化程度高 6. 应用范围广 实例 2、等速电泳(ITP) 等速现象：电泳静态达到后，被分离的离子淌度按顺序性梯形递减。 1964年，由于Everaerts和Martin的重要贡献，ITP正式诞生。在研究中，他们发现在ITP达到静态后，所有被分离的离子以相同的速度移动。因此，他们命名这一分离工具为iso-tach-phoresis (iso = equal = 相等，tach = velocity = 速度， phoresis = electrophoresis = 电泳)。 等速电泳图示 在等速电泳达到静态后，所有的被分离的区带以相同的速度向前移动，移动最快的离子为前导离子（leading ion），迁移最慢的离子为尾随离子（terminating ion），其它迁移速度介于两者之间的离子按速度大小依次分离。分离后的区带为近矩形，不同离子的区带与区带之间为“肩并肩”的形式。 在等速电泳中，区带之间的界面是非常清晰的。这是由于存在“自校正效应” 或“自锐利效应” 。如果前导离子扩散进入邻近的区带，由于前导离子淌度高于邻近的离子淌度，在邻近区带内前导离子速度会高于邻近离子速度，结果扩散进入邻近区带的前导离子重新迁移回自己的区带。分析其它离子的扩散迁移会得到类似的结果。 特点：界面明显，富集、浓缩作用。 等电聚焦电泳 方法 关键：pH梯度的建立 产生pH梯度的方法通常有两种： 一种是用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度，称为人工pH梯度。但这种pH梯度不很稳定，常用于制备电泳。 另一种是利用两性电解质载体（Carrier ampholytes）在电场的作用下自然形成pH梯度，称为天然pH梯度。 理想的载体两性电解质的合成 用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加合反应优先加在α、β不饱和酸的β碳原子上，调节胺和酸的比例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有机会合成不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里要求合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同系物，以保证的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，从而得到平滑的pH梯度。载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在300-1000之间。 优点：①使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；②由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；③电泳速度