图位克隆要点.pptVIP

植物基因分离的图位克隆技术 传统的基因功能克隆、表型克隆方法具有基因表达产物不清楚，难以进行相关基因分离等缺点。 目前，图位克隆技术日渐成熟，已成为分离基因的有效方法，并在分离不同的植物基因中得到了广泛的应 用。 目前，克隆基因的途径有2 种：正向遗传学(forward genctics)和反向遗传学(reverse genctics)途径。 前者是依据目的基因所表现的功能为基础，通过鉴 定其产物或某种表型突变而进行的；后者则着眼于 基因本身，通过特定的序列或在基因组中的位置进 行。传统的功能克隆(functional cloning)属于前者范 畴，它是根据已知基因的产物反推其核苷酸序列， 再据此序列设计探针或引物从cDNA 文库或基因 组文库中筛选克隆，也可以制备产物抗 体，从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克 隆，进而分离目的基因。 表型克隆技术都普遍存在着依赖于PCR 技术、重复性较差、假阳性率高、对实验材料要求较高、材料间不能存在过多的差异、结果不便确证等缺点。 近年来，反向遗传学的建立，为分离未知产物的基因提供了越来越多的策略和思路。如最常用的基因克隆技术有图位克隆和转座子标签技术就是基于反向遗传学原理发展起来的。 1 图位克隆技术的原理 功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA 文库(包括YAC，BAC、TAC 或Cosmid 等)，从而构建基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步移(chromosome walking) 逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing) (Tanksley et al., 1995)方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。 2 图位克隆的技术环节 2.1 筛选与目的基因紧密连锁的分子标记 实质上，分子标记是一个特异的DNA 片段或能够检出的等位基 因，精确的分子标记能够极大地提高图位克隆的效 率。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的 筛选，包括有：RFLP 标记、RAPD 标记、AFLP 标记、 SSLP 标记、SSR 标记、SNP 标记等。其中最为常用 的是简单序列长度多态性(SSLPs) (Lukowitz et al., 2000; Choe et al., 2002; Gonzalez-Guzman et al., 2002) 和单核苷酸多态性(SNPs) SSLP 是基于PCR 的分子标记，检测比较直接，只 需要通过设计引物便可检测假定的SSLP 标记；对 SNPs 标记的检测也比较直接，它是不同生态型之间 基因组中的单个核苷酸的差别，这些差别的核苷酸 通常位于不编码区域(Peters et al., 2003)。最常见的 用于检测SNPs 标记的方法主要是剪切扩增多态性 序列(CAPS)，它也是基于PCR 的。 另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS (dCAPS) (Michaels and Amasino,1998; Nam et al., 1989)可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在PCR 时引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。 2.2 目的基因的定位 目的基因的定位分为初定位和精细定位。目的 基因的初定位(mapping the target gene)是利用分子 标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基 因定位于染色体的一定区域内。初定位通常使用近 等基因系法(near-isogenic lines, NILs)或群组分离分 析法(bulk segregant analysis, BSA)。 近等基因系是指只有目标性状基因有差异，其它性状基因相同的2个群体，可以通过连续回交的途径获得。由于近等基因系需要连续的回交，所需的时间较长，Michelmore等(1991)提出了群组分离分析法，将分离群体中研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病)分成2组，将每组内一定数量的植株DNA 等量混合，形成 2个池，这2 个池仅在目标性状(如抗病性)上有差异。 利用分子标记技术寻找2 个池的扩增谱带的差 异，这种多态性极可能与目标基因连锁。再用所有 的分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基 因连锁及连锁距离的确定。如果分离群体不易获 得，可采取混合样品法。以抗病性为例，即尽可能地把所有的抗病品种的DNA 等量混合，作为1 个基 因池；把所有的感病品种的DNA 等量混合，作为1 个基因池，对2 个基因池的DNA 多态性进行分析。 在初步定位的基础上，接下来就要利用高密度 的分子标记连锁图对目的基因区