真核表达系统要点.pptVIP

真核表达系统 酵母 丝状真菌 昆虫 哺乳动物细胞 转基因动物 植物反应器 酵母表达系统的优缺点 遗传背景清楚（基因组是大肠杆菌的3.5倍） 增殖快（90min/代），培养容易，产量较高 易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工染色体等 可以进行转录和翻译后修饰加工 提纯工艺复杂，成本高，制品纯度达不到要求，制品免疫原性差，接种剂量大 酵母载体的基本结构 DNA复制起始区：2μ质粒和自主复制序列 选择标记：营养缺陷型和显性选择（抗药） 整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷贝数 有丝分裂稳定区：帮助载体平均分配 表达盒 转录启动子 终止子 分泌信号序列 酵母表达系统中载体的种类 按载体在酵母中的复制形式分为： YIp：酵母整合型载体 YRp：酵母自主复制型载体 YCp：酵母含着丝粒片段载体 YEp：酵母附加体型载体 YAC：酵母人工染色体 昆虫表达系统 杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb 启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子 表达系统 杆状病毒表达系统（BEVS） 家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统 宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫 克隆基因方法：转移载体→共转染→同源重组→空斑筛选→纯化→重组病毒 杆状病毒表达系统优点 容量大：能插入12kb的外源基因 高表达：polh基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶 高效：可同时表达多个基因 安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性 具加工修饰功能：昆虫细胞较高等 家蚕易饲养 哺乳动物细胞表达表达系统 常用宿主细胞 哺乳动物细胞常用载体 真核细胞表达元件 哺乳动物基因转移的遗传标记 基因表达的检测方法 哺乳动物细胞表达的优点 重组DNA易转染，遗传稳定，可重复 识别和去除内含子 进行翻译后修饰 磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠 产品的构型正确率高，可被改造成类人体源性，免疫源性好 可分泌至培养基，提纯工艺简单，成本低 可用于基因治疗 常用宿主细胞 真核细胞表达元件 原核DNA序列 启动子 增强子 拼接信号 终止子和多聚腺苷化信号 筛选标记 动物病毒基因序列 原核DNA序列 原核复制子 抗生素抗性基因 多克隆位点 启动子 真核启动子：RNA聚合酶（Ⅱ）结合并起动转录的DNA序列 一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长7-30bp 核心启动子元件：RNA聚合酶起始转录所必需的最小DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处的TATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录 上游启动子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。与相应的蛋白因子结合改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，即不同的基因表达分别有不同的调控 哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件 常用启动子 Rous肉瘤启动子（RSV） 巨细胞病毒启动子（CMV） SV40启动子 增强子 增强子：是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物、甚至在原核生物中都发现了增强子 增强子通常占100-200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，其基本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在 增强子的作用特点 提高同一链上基因转录效率，可远距离起作用，通常距离1-4kb、但远至30kb仍能发挥作用，在基因的上游或下游都能起作用 与其序列的正反方向无关 要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录 增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用 增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的 常用增强子 LTR：Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列 人类巨细胞病毒增强子 SV40病毒增强子 终止信号和poly A信号 真核基因转录的终止信号与机制还不明确 poly A增加mRNA的的稳定性 多聚腺苷化所需的两种序列 位于poly A下游GU丰富区或U丰富区 位于poly A上游11-30bp处的5`-AAUAAA SV40 poly A信号 遗传性标记 胸苷激酶基因（tk）选择系统 二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统 新霉素抗性基因（neo）选择系统 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统 胸苷激酶（TK）基因选择系统 TK是核苷酸补救合成途径的一个关键