多聚酶链式反应扩增DNA片段-解析.pptVIP

温故知新1: 组成DNA分子的基本单位是什么? 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? DNA分子结构有什么特点？ 复制特点 三、 PCR 的实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上 的一次性吸液枪头用一次更换一次 PCR仪 微量离心管 微量移液器 1、准备 2、移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 ①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。 ②注意： 3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。 4、离心 5、反应 ②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。 PCR三步曲 预变性 保温 变 性 94℃ 30s 延伸 72℃ 1min 复性 55℃ 30s 94℃ 5min 72℃，1min 55℃，30s 94℃，1min 最后一次 72℃，1min 55℃，30s 94℃，30s 30次 － － 94℃，5min 预变性 延伸 复性 变性 循环数 PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到： 6、注意事项 ①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌； ②PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ?分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头 （一）理论上DNA扩增数目的计算 四、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰， 峰值的大小与DNA的含量有关 稀释 2μLPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 测定 取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值 计算 DNA含量（ ?g /ml ）＝50 ×(260nm的读数）×稀释倍数 2.过程 比色杯 五、实验小结 PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 模板 互补 Taq聚合酶 四种脱氧核苷酸 引物 变性、复性和延伸 72℃ 1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段 （2n=230=1 073 741 824)。 2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。 课后题: * * 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 1 2 3 4 5 DNA的基本单位－脱氧核苷酸 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 脱氧核苷酸链结构简图 磷酸二酯键 A T G C A G C T DNA分子的平面结构 氢键 5端 3端 5端 3端 DNA分子的复制过程是怎样的？ DNA分子的复制需要哪些条件？ 温故知新2 DNA母链：提供复制的模板 解旋酶：打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 DNA复制的条件 半保留复制，边解旋边复制，多起点