第六章植物细胞培养.解读.pptVIP

1902年发表《植物离体细胞培养实验》， 提出胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法的科学预见。 他当时就预见到， 单细胞培养系统将有助于对植物细胞特性和潜力的研究 以及对多细胞有机体细胞间相互关系的了解。 现在， 不仅能够培养游离细胞， 还能使离体单细胞发生分裂，并产生完整植株。 植物细胞培养（plant cell culture） 是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞（或小细胞团） 进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。 单细胞培养就是对分离得到的单个细胞进行培养， 诱导其分裂增殖，形成细胞团， 再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体， 直至长成完整植株的技术。 它是常用的细胞培养方法。 培养中的细胞在遗传和生理生化上会出现变异， 形成的植株就表现出一定的差异 （这种差异主要反映在它们的产量、品质、抗病虫和抗逆性等方面）。 可以用于突变体筛选，选育出符合生产需要的新品种。 1.平板培养 把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合， 并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。 广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。 （1）取处于活跃生长期愈伤组织块， 无菌条件下，愈伤组织块安放在培养瓶中。 （2）在愈伤组织上放８mm×8mm的无菌滤纸片，置培养室中放过夜。 使其充分吸收组织上渗透出的培养基成分和组织块的代谢产物。 （3）从悬浮培养物或疏松的愈伤组织上分离出单细胞， 并把单细胞接种在培养瓶中的滤纸上面。 （4）恒温培养 当这个培养的细胞长出微小的细胞团后， 将它转到琼脂培养基上，以便进一步促进其生长。 由Jones等1960年设计的， 人工制造一个小室（载玻片和盖玻片）， 将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。 小室可通过毛细管与外界通气，便于观察。 注意：载玻片厚度1mm，微室厚度最好不超过20μm， 盖玻片厚度在0.17-0.18mm左右，观察效果才好。 此法的优点 在培养过程中可以连续进行显微观察， 把1个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全过程记录下来。 由悬浮培养液中取出一滴只含有单细胞的培养液，放在一张无菌载玻片上， 在这滴培养液四周与其相隔一定距离加上一圈石蜡油，构成微室的“围墙”。 在“围墙”左右两侧再各加一滴石蜡油， 再在每滴石蜡油上放一张盖玻片作为微室的“支柱”， 然后将第3张盖玻片架在两个支柱之间，构成微室的“屋顶”。 这样含有细胞的培养液被覆盖于微室之中， 构成围墙的石蜡油能阻止微室中水分的丢失，且不妨碍气体的交换， 最后把有微室的整张载玻片放在培养皿中培养。 当合成培养基中的细胞或细胞培养由于起始密度太低而不能发生分裂时， 可采用条件培养基。 所谓条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养， 一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。 方法 把液体培养基中培养了4-6周的高密度细胞虑掉， 将其培养基制成液体培养基或固体培养基 来培养单细胞或低密度细胞群体， 这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能力。 细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、适合悬浮培养的细胞株。（1）从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快的浅色愈伤组织。（2）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团。（3）接种在固体培养基上培养2周。（4）挑选生长快的细胞株并继代培养。（5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定， 筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。 1. 分批培养（batch culture）是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界交换外，一切都是密闭的。 分批培养所用的容器一般是100-250mL三角瓶， 每瓶装20-75mL培养基。 为了使分批培养的细胞不断增殖，必须及时进行继代。 继代的方法 ◆可以是取出培养瓶中一小部分悬浮液， 转接到成分相同的新鲜培养基中； ◆也可用纱布或不锈钢网进行过滤，滤液接种， 这样可以提高下一代培养物中单细胞的比例。 根据培养基在容器中的运动方式来区分，有以下4种方法： ◆旋转培养 ◆往返振荡培养 ◆旋转振荡培养 ◆搅动振荡培养