酶标记和免疫层析法技术.解读.pptVIP

酶标记和免疫层析法技术黄陂区人民医院 一、酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1、1简介：基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性 1.2、ELISA方法简介： ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单易行并可以定量，从而使其在医学检验中得到了广泛的应用。 1.3、ELISA方法的原理 基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以聚苯乙烯塑料微孔板为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附）在酶标板微孔的内壁上成为包被抗体或抗原，没有被吸附的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗原形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，在微孔中加入底物溶液，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用酶标仪进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是ELISA的原理。 1.4、ELISA方法的分类 ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。 直接法： 直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图2-17（a） 间接法： 是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。见图2-17（b） 夹心法： 是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，见图2-17（C）。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。 ELISA原理及分类（图2-17） 上述三种方法又可以分为竞争法和非竞争法。下面对直接法中的酶标抗原竞争法作重点说明。 在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和非酶标抗原（通常来自于待测样品），酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，经过温浴后，没有结合到包被抗体上的酶标记物和样品经过洗涤去除。拍干后加入底物溶液，经温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。其反应原理如（图2-18） 竞争法ELISA原理简述 如图所示.在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和待检样本（抗原），酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微孔内，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化还原成为有色的产物。 当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物结合加入底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在固相上的抗体就越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用酶标仪进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是竞争法ELISA的原理。 2、ELISA试剂的组成 完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）系列参考标准品（定量测定）；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液；（7）反应终止液。 酶标记物： 即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离