核酸的制备分析报告.pptVIP

基因工程 第一章 核酸的制备 DNA 的提取与纯化是基因工程操作的重要技术。由于基因工程操作大部分要靠生物酶来进行，因此对DNA的质量要求十分高，不纯的DNA往往是整个工程的限速因素。DNA的提取和纯化主要技术为碱抽提法、煮沸法、氯化铯超离心法、柱层析法等。因方法的简繁、费用的高低、对设备的要求及产物的质量的严格程度不同而各具优缺点。 第一节 天然DNA的制备 天然DNA包括染色体DNA、质粒DNA、病毒DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA。 基因工程中最常用到的DNA是染色体DNA和质粒DNA。 一、DNA的组成和结构 DNA是脱氧核糖核酸的简称，是由4种脱氧核糖核苷酸按照一定顺序聚合而成的大分子。 核苷酸简写为nt,由五碳糖(核糖或脱氧核糖)、磷酸和碱基组成。 在脱氧核糖核苷酸链中，各个脱氧核糖核苷酸的脱氧核糖和磷酸基团的结构和位置相同，只有碱基不同。因此，可用碱基(bp)序列表示核苷酸(nt)序列。 大部分DNA都是以双链存在。真核生物的染色体DNA为双链线状，真核生物的细胞器DNA、原核生物的染色体DNA、质粒DNA多为双链环状。 二、天然DNA的提取 提取DNA，一般要裂解细胞，去除杂质(蛋白质、多糖等)，分离出DNA,再进一步纯化。 现在有多个公司提供DNA提取试剂盒(植物基因组DNA、血液DNA、土壤DNA、细菌DNA、质粒DNA)，可方便快速地获得高质量的核酸样品。 (一)生物材料的准备 新鲜，或者冻存的样品 (二)裂解细胞 1.化学方法 CTAB裂解法：十六烷基三甲基溴化铵，阳离子去污剂，裂解细胞 膜，将DNA与多糖分开。 SDS裂解法：十二烷基硫酸钠，阴离子去污剂，蛋白质溶解型变性剂，能将细胞裂解，沉淀多糖。 2.酶裂解法 (1)蛋白酶K裂解法 蛋白酶K可有效地降解蛋白质 (2)溶菌酶裂解法 破坏细菌细胞壁的肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下使细胞胀裂。 酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等 丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 3.物理法 (1)研磨破碎法 (2)液氮冻融破碎法 (3)煮沸破碎法 (4)微波破碎法 (5)超声波破碎法 (三)DNA的分离和抽提 (1)酚-氯仿抽提法 苯酚、氯仿是蛋白质沉淀型变性剂。 (2)盐析法 用饱和NaCl盐析沉淀蛋白质，而DNA仍溶解于上清液中。 (3)氯化铯密度梯度离心法 CsCl法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速离心机。 苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分子断裂。若小心操作，所获DNA亦符合要求。 (4)固相萃取法 (四)DNA的纯化和浓缩 1.DNA的纯化 (1)RNase处理 (2)氯化铯-溴乙锭连续梯度离心法 上清液→加入固体CsCl与EtBr溶液→室温下超速离心(45,000rpm）16小时→ 穿孔取出DNA（320nm） →异丙醇抽提溴乙锭→缓冲液透析除去残余CsCl →两倍体积冷冻乙醇沉淀DNA→离心、洗涤、干燥 (3)离子交换层析法 (4)琼脂糖凝胶电泳洗脱法 2.DNA的浓缩 乙醇沉淀法 正丁醇抽提法 聚乙二醇浓缩法 第二节 天然RNA的制备 制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用 1)??RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 0~65℃均具活性；抗变性剂 2)??解决办法： 外源RNase—高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套 内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等 第三节 人工合成核酸片段 一、核酸的化学合成 二、核酸的酶法合成 故事发生在1983年的春夏之交 很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一 Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼