生工--分子生物学实验指导(学生用2009).docVIP

分子生物学实验指导 实验一 实验材料和物品的准备 实验思路与设计： 基因工程是现代生物技术的核心。本实验设计从质粒DNA提取开始，通过DNA的提取及质量检测、等实验，使学生掌握基因克隆的基本思路和方法。分子生物学实验所用物品清单 以下物品每组（两人）一套： 枪头盒1000ul 1个/组 枪头盒200ul 1个/组 小烧杯 2个/组 三角瓶 2个/组 培养皿 2个/组 双面板 1个/组 记号笔 1只/组 移液器1000ul 1只/组 移液器200ul 1只/组 移液器20ul 1只/组 以下物品每两组（四人）一套： 移液器0. 2ul 1只/2组 枪架 1个/2组 研钵 1个/2组 标签纸 1张/2组 枪头盒10ul 1个/2组 镊子 1个/2组 剪刀 1个/2组 量筒（10ml） 1个/2组 量筒（50ml） 1个/2组 核对无误后请每组负责人在清单上签名。 实验内容： 1、微量取液器的正确使用 量程的正确选择（不要将指数旋过量程范围） 轻拿轻放 下压推杆至第一档垂直取样，放样时下压推杆至第二档。 、将枪头摆放在枪头盒中，灭菌。 3、将0. 2ml、1. 5ml离心管放小烧杯中，灭菌。 4、配制酚—氯仿（Tris饱和酚：氯仿=1∶1）50ml。 5、离心机的正确使用。 6、灭菌锅的正确使用。 7、PCR仪的正确使用。 8、凝胶成像仪的使用 、电泳和电泳仪的使用 1、每个三角瓶中配20ml的LB培养基（蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，NaCl1%），封口灭菌。11、每两组接种一瓶GST质粒DH5α菌株（培养基中加入20ul 100mg/ml的氨苄青霉素）；37oC、230r/min培养过夜。 实验质粒DNA的提取 [实验目的] 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒 [实验原理] 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12. 0-12. 5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入Ph4. 8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 [仪器、材料与试剂] （一）仪器 1. 恒温培养箱 2. 恒温摇床 3. 台式离心机 4. 高压灭菌锅 （二）材料 1. 葡萄糖 2. 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3. 乙二胺四乙酸（EDTA） 4. 氢氧化钠 5. 十二烷基硫酸钠 6. 乙酸钾 7. 冰乙酸 8. 氯仿 9. 乙醇 10. 胰RNA酶 11. 氨苄青霉素 12. 溴酚兰 14. Tris饱和酚 15. 盐酸 16. 含GST质粒的大肠杆菌 17. 吸头、小离心管 (三)试剂 溶液I：葡萄糖 50 mmol/LTris（pH8. 0） 25 mmol/L EDTA（pH8. 0） 10 mmol/L 115℃灭菌，4℃保存。 溶液II： 氢氧化钠 0. 2 mol/L SDS 1% 现用现配。先加水、再加NaOH，最后加SDS，顺序不可颠倒。 溶液III 5 mol/L 醋酸钾 60 ml 冰醋酸 11. 5 ml 去离子水 28. 5 ml 4℃保存。 [实验步骤] 1. 加含质粒的菌悬液20ul于20mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB培养基中培养，37℃培养过夜。 2. 取1. 0 mL细菌培养物，加入1. 5ml离心管中，8,000 r/min离心1 min。 3. 除净上清，加100μL溶液I，用涡旋仪振荡混匀。 4. 加200 μL溶液II（现用现配），盖紧管盖，迅速颠倒混匀，作用时间不要超过5min。 5. 加150 μL冰冷的溶液III（冰上预冷），盖紧管盖，颠倒混匀，冰浴10 min。6. 12,