分子生物学第9章资料.ppt

第三节PCR体系组成和反应条件优化 一、体系组成 DNA聚合酶 引物（Primer） dNTP（原料） 目的DNA模板 缓冲液（Buffer） (一)DNA聚合酶 (二)引物 引物设计原则: 1·引物长度 15-30nt 2·引物组成 G/C含量以40%-60%为宜 3·引物结构 碱基随机分布、二级结构、引物二聚体，3‘端不应有三个连续的G/C，5’端可以修饰 4·引物特异性 与其他序列的同源性一般≤70% 5·引物浓度 非特异性扩增，引物二聚体 6·引物质量 纯化 (三)dNTP 1·应当根据目的DNA的长度和组成确定dNTP的浓度 2·四种dNTP要等摩尔浓度配制 3·dNTP的质量也与扩增效率有密切关系 (四)模板 DNA或RNA（先逆转录合成cDNA） 来源:根据科学研究或临床检验的需要，可以是临床标本 (血液、尿液、羊水、分泌物等)、药物标本 (动植物细胞、组织等)、法医标本 (犯罪现场的血渍、精斑、毛发等)、病原体标本 (病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次体等)、考古标本(骨骸、毛发等) 无论何种来源的标本，都应该进行预处理 (五)缓冲溶液 维持DNA聚合酶的活性和稳定性 1、pH=7·2 2、50mmol/L KCl可以促进引物退火，但浓度过高会抑制酶 25mmol/L (NH4)2SO4，SO4对金属离子有一定的结合力。 3、小牛血清白蛋白或明胶可以维持酶活性，能保证PCR的稳定性 4、甲酰胺或二甲基亚砜有利于松解发夹结构等二级结构，促进引物退火 5、Mg2+:影响酶活性及变性解链、引物退火、扩增效率、扩增特异性等 二、条件优化 (一)反应温度和反应时间 1·变性温度和时间 95℃30秒或97 ℃15秒 2·退火温度和时间 退火温度应当低于引物Tm值3-5 ℃ ，通常为50-65 ℃ ，20-40秒钟 3·延伸温度和时间 TaqDNA聚合酶的最适温度为75-80 ℃ ，72 ℃，1min (二)循环次数 循环次数决定PCR扩增效率 一般控制在30-40次 酶活性下降、dNTP浓度下降等，会使反应进入平台期 三、产物分析 (一)电泳分析 (二)酶切分析 既能对PCR产物进行鉴定，又能对靶基因进行分型 (三)杂交分析 检测PCR产物特异性，是否存在变异 (四)序列分析 检测PCR产物特异性最可靠的方法 第四节 常用 PCR技术 一、逆转录PCR (RT-PCR) 一步法:逆转录和PCR在同一个反应体系中进行 两步法:逆转录和PCR在两个反应体系中分开进行 引物很关键。 ①oligo(dT)引物 ②特异性引物 ③随机引物 逆转录PCR可以与DNA印迹法联合，分析扩增产物，从而分析样品中的RNA含量，研究基因表达 逆转录PCR灵敏度较低，属于半定量分析 二、实时定量PCR (Q-PCR) 对荧光信号的实时检测来跟踪PCR进程，标准曲线定量分析起始模板水平 1·实时定量PCR探针 特异性荧光探针：荧光报告/淬灭基团 EB或SG作为荧光探针 2·实时定量PCR应用 与逆转录联合可以定量分析mRNA以研究基因表达 基础研究与临床诊断 3·实时定量PCR特点 PCR高效性、核酸分子杂交特异性、荧光技术高灵敏度和可计量性、TaqDNA聚合酶的外切酶活性 封闭条件，没有污染，自动化程度高，多重反应 定量原理 确定初始模板的浓度 初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值） Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 三、修饰引物PCR 对特定DNA序列进行定向克隆 、定点诱变 、体外转录等研究时，需要其末端带有限制位点、突变序列、启动子等DNA元件，为此可以在PCR引物的5‘端加接这些元件进行扩增，这就是修饰引物PCR 例如:在引物5，端加接限制位点，就可以用限制酶切割扩增产物，形成黏端，从而与有互补黏端的载体DNA重组，这就是克隆PCR 克隆PCR克隆效率较高，并且如果给两个引物加接不同的限制位点，可以进行定向克隆 四、等位基因特异性PCR 等位基因特异性PCR(AS-PCR)用于检测点突变 原理:同时设计一个正常引物对和一个突变引物对 下游引物完全一样，上游引物3‘末端的碱基不同 两个PCR体系，各加入一个引物对 等位基因特异性PCR用于鉴定单核苷酸多态性 (SNP) 五、PCR-RFLP 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术 (PCR-RFLP)是PCR技术与RF分析的联合，即先用PCR将包含待测多态性位点的DNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶切割，电泳分析其RFLP，判断是否存在突变 PCR-RFLP可以极大地提高RFLP分析的