生物技术知识总结与复习题.docVIP

一 基因工程的基本步骤： （1）分离：提取和获得目的基因和载体DNA； （2）切割：分别对目的基因和载体DNA酶切； （3）连接：目的基因与载体连接，形成新的重组 DNA分子； （4）转化：用重组DNA分子转化受体细胞； （5）筛选：能在受体细胞中复制和遗传；对转化子筛选和鉴定； （6）表达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 二 常用工具酶: Ⅱ型核酸内切限制酶: 基因工程说到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此类酶的微生物限制－修饰系统分别由限制酶和甲基化酶来完成。Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2＋作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同 (1.识别核苷酸序列，大多有回文结构 2. 具有特定的酶切位点) 在其识别位点之中或邻近的确定位点特异地切开DNA链,产生特异的DNA片段,是I II III类中唯一用于DNA分析和克隆的一类.有一些限制酶的识别序列是不对称的,有一些限制酶可识别多种序列.限制酶识别序列的长度一般为4~8个碱基,最常见的为6个碱基. (Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段)限制酶产生的末端: 粘性末端：产生的 DNA片段末端的一条链多出一至几个核苷酸。3′端比5′端长的称为3′粘性末端，5′端比3′端长的称为5′粘性末端。 平末端：产生的DNA片段末端是平齐的. 同裂酶：来源不同但具有相同的识别序列的限制性内切酶被称为同裂酶,产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶：来源不同、识别序列也不同，但产生相同的黏性末端，叫同尾酶。 由同尾酶产生的DNA片段是能够通过碱基互补彼此连接起来，但重组后的片段不能被前述两种酶中的任何一种所识别。 限制酶的用途 1 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制片断 2.建立限制酶（物理）图谱绘制 3.构建基因文库 4.用限制酶切出相同的粘性末端，以便重组 DNA聚合酶(从DNA的5`端起始开始复制到3`端的酶):共同点是：它们都能够把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。 常用的聚合酶有：1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coli DNA聚合酶Ⅰ，PolⅠ）: 基本酶活性： 5‘→3‘的DNA聚合酶活性， 5‘→3‘的核酸外切酶活性， 3‘→5‘的核酸外切酶活性。发挥生物学活性的条件： DNA 模板（可以是单链或双链），带有3`-端游离羟基的引物链，底物和激活剂用途：用缺口平移方法标记DNA；对带有3’突出端的DNA分子进行末端标记；补平或标记限制性内切酶消化后产生的3’凹端； 2大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段（Klenow酶）:性质：经过枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶Ⅰ，或用基因工程手段去除全酶中的5‘→3‘的核酸外切酶活性片段，而还具有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性的全酶大片段. 主要用途：标记DNA片段的末端,在无底物时只进行3′→ 5′外切；有底物存在时则聚合。 T4DNA聚合酶: 具有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性,但其3‘→5‘的核酸外切酶活性比Klenow酶强近200倍,无5`到3`外切酶活性.用途：对带有3’突出端的DNA分子进行末端标记；补平或标记限制性内切酶消化后产生的3’凹端；将双链DNA的末端消化成平末端，这是其强劲的3‘→5‘的核酸外切酶活性才能做到的。 耐热DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）:显著特点是热稳定性. 应用：（1）DNA 序列测定（2）PCR (polymerase chain reaction)对DNA 的特定片段进行体外扩增。如：TaqDNA聚合酶能在72℃条件下以单链DNA为模板按5‘→3‘方向合成新生互补链 末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）: 性质：使DNA片段平末端的3′-OH加上同聚核苷酸产生黏性末端。主要用途：分别给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以便使外源DNA 与载体连接。 甲基化酶:用于保护宿DNA不被切割,甲基化酶可以用来改变内切酶的识别特异性,且这种特异性的改变具有专一性. 三 其它工具酶 DNA连接酶: 催化机理：催化双链DNA片段紧靠在一起的3′OH末端与5′ P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。常用的连接酶：E.coli DNA 连接酶：只能连接具有黏性末端的DNA片段 ，由NAD+供能。T4 DNA 连接酶：连接黏性末端、平末端的DNA片段 ， 由ATP供能.作用:能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子 反转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶):以RNA链为模版聚合cDNA链..基本特性:双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链. 依赖于DNA的RNA聚合酶