生物化学实验指导(参考)1.doc

实验二、　紫外吸收法测定核酸的含量 一、 目的 1、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 2、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。 二、 原理 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C一），能够强烈吸收250～280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。 在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。 核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化。它们的经典数值（pH = 7.0）如下： DNA的ε（ρ）= 6 000 ～ 8 000 RNA的ε（ρ）= 7 000 ～ 10 000 小牛胸腺DNA钠盐溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 6 600，DNA的含磷量为9.2%，含1μg/mL DNA钠盐的溶液光密度为0.020。RNA溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700～7 800，RNA的含磷量为9.5%，含1μg /mL RNA溶液的光密度为0.022～0.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm波长下，浓度为1μg/mL的 DNA溶液其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA溶液其光密度为0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。 该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg／mL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。 由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约40％，这就是众所周知的增色效应（hyperchromic effect）。在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应（hypochromic effect）。 蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1∕10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值.在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法事先除去。 三、实验材料、主要仪器和试剂 （一）试剂 1．标准核酸溶液（酵母RNA或小牛胸腺DNA，用0.01NaOH溶液配制成500μg/ml溶液） 2．待测核酸样品 （二）器具 1、紫外分光光度计 2、微量注射器（50μL） 3、移液管 3．试剂 （1）5%～6%氨水：用25%～30％氨水稀释5倍。 （2）钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中。 四、操作步骤 （一）核酸紫外吸收光谱的测定 取100μL的RNA溶液于试管中，加入5 mL蒸馏水，摇匀，测定核酸溶液在220～290nm波长范围的消光值，再用蒸馏水作空白调零。以该溶液在各波段的光吸收值（即A值）为纵坐标，波长为横坐标，绘制核酸的吸收光谱。 （二）核酸溶液含量的测定 将上述测吸收光谱溶液的A260直接计算溶液的RNA含量 五、注意事项 如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵——过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液A值作为对照。 六、思考题 1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？ 2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？ 参考答案 1．用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。 2．当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得的样品液260nm光密度中扣除。 实验三 植物体内过氧化氢酶活性的测定 一、目的 过氧化氢酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系，故常加以