研究方法分析报告.ppt

原生质体－光镜＼黄芪叶肉细胞 过氧化物酶－冰冻切片 木质素显色 冰冻　　　石蜡 海参体壁细胞－电镜 宏观、分子、超微结构技术结合 分子、荧光、共聚焦 电生理（细胞）、荧光 Ｃa2+-ATPase电镜化学 作 业 1、什么是分辨率？怎样提高显微镜的分辨率？ 2、电子显微镜与普通光学显微镜的区别？ 3、荧光显微镜的原理和举例其在生物学研究中的应用。 4、什么是组织化学、细胞化学、免疫组织化学、免疫电镜化学？ 电子显微镜的样品制备 如同光学显微镜，电子显微镜的样品也需固定、包埋、切片、染色等。 电子显微镜样品的制备过程 与光镜相比， 用于电子显微镜的组织固定有什么特殊的要求? 负染色(negative stainning) 一些生物大分子组成的结构，如病毒、线粒体基粒、核糖体和蛋白质组成的纤维等可以通过负染色电镜技术观察其精细结构，还可以从不同角度观察三维结构。 烟草rattle 病毒的负染色 铸型技术(shadow casting) 铸型技术是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。 图2-23 铸型技术 ● 冰冻断裂复型和冰冻蚀刻 是专门观察样品外表面的投影复型术。 冰冻断裂与冰冻蚀刻技术 2.1.5 间接成像技术 光学显微镜和电子显微镜是利用质子和电子使样品直接成像的技术，还有一些显微方法是间接成像。所谓间接成像，举一个例子， 假定你拿起一个物体，非常靠近你的眼睛进行观察，你或许觉得该物体有六个平面、十二条边和八个角，然后将你感觉到的画出来，可能是一个盒子，这就是间接成像。下面讨论的是几种间接成像的方法，这些方法都具有原子级分辨力，它们的分辨率比最好的电子显微镜还高10倍。虽然这些方法目前都还有一定的缺陷限制着在生物学中的应用，但具有发展潜力。 扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope，STM) ■ 扫描隧道显微镜由IBM公司瑞士苏黎世研究所的两位学者Binning G.和Rohrer H.等在1981年发明的具有原子显像力的显微镜，是根据量子力学中的隧道效应原理而制成的。这种显微镜对生物、物理、化学等学科均有推动作用，可用于研究表面的原子结构和电子结构(图2-25)，故于1986年获得了诺贝尔物理学奖。 扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜观察的DNA双螺旋结构 DNA双螺旋结构的建立是根据 X 射线衍射结果推导出来的，至今还没有直接观察 DNA结构的方法，所以对其中的微细结构还不够了解。用STM观察了DNA的双螺旋结构， 见到 DNA分子上的大沟(major groove)和小沟(minor groove)，并且了解DNA的结构随染色体长度而异。 电子染色 标本对电子的散射能力取决于其组成元素的原子序数,原子序数越高,散射的电子越多,反差就越大。生物分子是由一些原子序数很低的轻元素(氢、氧、碳、氮等)组成的,它们散射电子的能力很弱,在电镜下几乎不存在明暗反差。为使生物样品加大反差,就要进行染色,即用重金属增加电子散射能力,称为电子染色。 负染技术 用重金属盐（如磷钨酸）染色：吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属，而凸出的地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨率可达1.5nm左右 2.3 细胞化学技术 2.3.1 酶细胞化学技术 酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。 2.3.2 免疫细胞化学技术 ? 免疫荧光技术 ? 免疫电镜技术 2.4 放射自显影技术Radioautography 放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子(α或β离子)作用于感光材料的卤化银晶体,从而产生潜影。这种潜影可用显影液显示,成为可见的“像”。因此,它是利用卤化银乳胶现象,检查和测量放射性的一种方法。 放射自显影术 2.5 分析细胞学技术 2.5.1 流式细胞术 (Flow cytometry) ?流式细胞器 (Flow cytometer,FCM) 流式细胞术 细胞分选 细胞标记 染色体分选 2.6 细胞工程技术 (Cell Engineering) 2.6.1 细胞培养 ? 体外细胞培养的条件 无血清培养∶ 环境因素∶ 无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境、O2和CO2。后者对于维持细胞培养液的酸碱度十分重要。 代谢物和废物排除： 2、7 生化与分子技术 细胞化学技术 细胞器分级分离技术 2.8 显微操作技术 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或胚胎操作的一种方法 包括细胞核移植、显微注射、胚胎移植及显微切割等 2.9 细胞培养与杂交技术 细胞生物学研究常用模式材料 认识几种显微照片表示的