实验七琼脂糖凝胶电泳教案解析.ppt

实验七 琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法的方法。 琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持物，在适当条件下对带电生物大分子进行电泳的技术。主要用于DNA分子的分离、纯化和鉴定。 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 二、实验原理 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射橘黄色荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样。 三、实验仪器、材料和试剂 实验提取的细菌基因组DNA和16S rDNA样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6×载样缓冲液 1?TAE缓冲液 4℃ 保存备用 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液 6?载样缓冲液 四、方法与步骤 1．取琼脂糖0.5 g，加入50 ml 1xTAE电泳缓冲液中，微波炉加热溶解，冷却至60 oC左右，加入EB至终浓度0.5 μg/ml，轻轻摇匀，不要起气泡。 2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，放好梳子。 3．铺板：将琼脂糖倒入凝胶槽中，胶厚约5~8 mm，静置冷却30 min以上。 4．待胶彻底凝固后，小心拔出梳子，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm。 5．DNA样品与载体缓冲液5:1混合并加入凹孔中。 6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。 7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5s RNA和0.3kbDNA之间）。 8．电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。 五、实验结果 六、思考题 琼脂糖电泳操作应注意哪些问题？ 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围